重庆武陵山区野生羊肚菌的分子鉴定研究.pdfVIP

103 第 2 期 王正春等:重庆武陵山区野生羊肚菌的分子鉴定研究 颠倒后离心 ( 4C， 18 仪)() g , 2 min) 。 弃去上消 1 研究材料 液，再用75 %的冰乙醇洗涤1 次， 置于室温下干 燥后，加入 10 - 20 件Lπ 缓冲液溶解后，即为 1. 1 供试菌株 DNA 模板稀释液。 用紫外分光光度计检测 DNA 模 菌株来源于重庆市林业科学研究院三峡库区森 板稀释液的浓度与纯度. -20C保存备用。 林生态保护与恢复重庆市市级重点实验室 (2011 2.2.2 ITS 区序列的 PCR 扩增 -∞5 号)。 该菌株由采摘于彭水县太原乡的野生 采用真菌通用引物 ITSl ， 1154 进行 ITS 区序 羊肚菌子实体经过组织分离法得到的纯菌种例。 列的扩增。 25μ.PCR 反应: 1 x PCR 缓冲液， 1.2 培养基 0.625U Taq 酶， 1. 5mM MgC12 , 0.2mM dNTPs , PDA 培养基:马铃薯2∞ g、葡萄糖20 g 、琼 O. 4~M prímer ITS 1, 0.4μM primerl154, 50 - 1∞ng 脂20 g 、水 1 000 mL。 DNA 模板稀释液。 反应程序: 94C 2 min; 94C 30 1. 3 试剂、材料与仪器 s , 59C 30 5 , 72C 90 s , 3S Cycles; 72C 7 min。 2.2.3 PCR 产物检测及测序 真菌裂解液，标准PCR 体系，冰乙醇， TE 缓 冲液，绿如蓝低毒核酸染料 (DNAGREEN) 。 取10 件LPC~ 扩增产物，用绿如蓝低毒核酸染 真茵通用引物口SI (5 - TCCGTAGGTGAAC- 料染色，用1. 8%琼脂糖凝胶于凝肢电泳仪上进行 CTGCGC - 3) 和 I白4 (5 - TCCTCCGCTTATT- 电泳，然后将琼脂糖凝脏置于 Bio - Rad 凝胶成像 GATATGC - 3 ,.) (由上海英激捷基生物技术有限 系统中检测并观察结果。 果用胶回收试剂盒(Bio 公司合成)， pMD 19 - T 载体，大肠杆菌(Es- Flux) 进行割胶回收，用紫外分光光度计检测回收 cheríchiacoli )感受态细胞DH - 5a。 条带中 DNA 的浓度与纯度，稀释后与 pMD 19-T 紫外分光光度计 (BACKMAN COLTER 载体按一定比例混合(详见 pMD 19 - T Vector 操 DU8∞)， PCR 仪 (EDC810) ，凝胶电泳仪 (DYY 作手册) ，置于 PCR 仪上 (16C， 4 h) 连接构建 -6C). Bio - Rad 凝胶成像系统 (Gel Doc XR) , 重组质粒pMD 19-T。 完成后，连接产物转化大肠 胶回收试剂盒 ( Bio Flux) 。 杆菌 DH - 5a 感受态细胞，在含有氨节抗性 (Amp ) 的 LB 平板中筛选阳性克隆