d2 菌种的保藏与复壮.ppt

第二章 菌种选育、保藏与复壮 菌种是发酵与酿造必不可少的，其活性和纯度是发酵工作的顺利进行的保证。在发酵与酿造工业中必须 选择适宜的菌种 选育生产性能良好的菌株 做好菌种的保藏。 菌种经长期使用和保存会发生变异造成退化，导致其形状和生产能力的下降。 发酵和酿造还要进行菌种的纯化与复壮。 第一节 菌种选育 讨论： 菌种选育的理论基础包括哪些内容？ 菌种退化变异的原因有哪些？ 菌种的自然选育程序包括哪几步？ 紫外线诱变的机理是什么？ 化学诱变剂的作用机理? 影响诱变的因素有哪些？ 问题讨论 杂交育种时，为什么要对直接亲本菌株进行遗传标记？ 如何筛选营养缺陷型？ 第二节 菌种保藏与复壮 一、菌种保藏 ? 二、菌种的提纯与复壮 一、菌种保藏 菌种保藏：是将所用的微生物以特定培养形态在特定的环境条件下存放，以保持种的存活、纯粹和遗传性状的稳定。 条件： 低营养、干燥、隔氧、低温 原理： 在以上条件下可以使微生物细胞降低代谢速率或暂时处于休眠状态 另外,密封可以保持干燥、隔氧、防止杂菌污染 菌种保藏方法 常用的菌种保藏方法 常用的菌种保藏方法有下列几种: (一)低温定期移植保藏法 (二)石蜡油低温保藏法 (三)干燥保藏 (四)甘油管保藏法 (五)真空冷冻干燥法 (六)液氮超低温保存 (一)低温定期移植法 方法：斜面菌种—→低温、干燥处保藏 或者：半固体培养基—→穿刺接种—→培养—→发好菌—→低温保存（优于斜面菌种） 保存温度：4℃冰箱 适应对象：细菌、酵母菌；不适合贵重菌种和生产优良菌株 优点：简便易行，对设备要求低。 缺点：菌种处于抑制状态，易退化，需3-6个月转接一次，连续转代可使生产性状丢失，易被污染 (二)石蜡油低温保藏法 方法：斜面菌种—→灭菌石蜡(高出斜面1～1.5cm)—→橡皮塞封口—→-4～４℃保藏 适应对象：不产孢子，不以石蜡为碳源的菌种 优点：保存时间较长，1～2年 缺点：有的菌种对石蜡敏感，不适合用此法 （三）干燥保藏 干燥饱藏法：使菌处于干燥条件下停止生长及处于休眠状态，达到较长期保藏的目的。 适应对象：细菌芽孢或产分生孢子的菌种（在发酵工业中常用）。 为了转接方便，控制接种量以及对菌种的保护，常将菌种的分生孢子、芽孢、菌丝体吸附于一些载体表面，放至干燥容器里进行干燥，所用载体有沙土、滤纸、硅胶及大(小)米等。 特点：保存时间长 1.沙土管法 方法： 河(海)沙，过0.78mm(24目)筛，用10％盐酸浸泡24h，清水冲洗至pH呈中性，烘干。 菜园或果园土粉碎过筛，烘干。 烘干的沙土按3:2或1:1混合装入指形管或小试管(100×10mm)，高约1cm，塞棉塞。灭菌。 肉汤检查确定无菌后备用。 将斜面菌种制成浓孢子悬液(≥106/ml)，用滴管吸取孢子悬液滴入无菌沙土，每管0.3～0.5ml，并将其混合均匀。 抽真空干燥，置干燥器4℃下保存 1.沙土管法 对产孢子真菌：接种环—→挑取分生孢子—→沙土—→干燥器内保存。 适用对象：霉菌、放线菌和形成芽孢的细菌 优点：保存时间长，一般1-3年以上 沙土管保藏的土霉素和链霉素产生菌保藏期达18年，新霉素产生菌22年 缺点：不适合于易变异的菌株 沙土保藏初期，菌死亡率高，以后逐渐减慢，存活下来的孢子在以后保存期间稳定性较好 2.滤纸保藏法 方法： 3#滤纸剪成5×50mm的条，—→干燥培养皿中灭菌。 菌种用灭菌脱脂乳制成孢子悬液 滤纸条—→浸入菌悬液—→取出—→灭菌小试管或安瓿管—→真空干燥机抽干—→真空下火焰熔封，冷藏。 3.大(小)米保藏法 方法：将大量产生孢子的霉菌直接在大(小)米培养基上培养，待孢子充分成熟，干燥，保藏。 保存时间：4℃冰箱，3-6个月； 真空抽干后密封，保藏6-12个月。 适应对象：霉菌 (四)甘油管保藏法 方法： 80%的甘油—→高压蒸汽灭菌。 斜面菌种—→高浓度的菌悬液(108～1010/ml)。 取1ml灭菌甘油—→灭菌小管—→ 1ml菌悬液与甘油充分混匀—→-20℃下冷冻保存。 (五)真空冷冻干燥法 适应对象：病毒、细菌、放线菌、酵母及丝状菌孢子等。不宜于丝状真菌的菌丝体。 优点： 菌种存活时间长，一般可保存5年以上，有的保藏15年以上不发生变异。 体积小、不易污染、便于运输等优点。 真空冷冻干燥法 1、设备： 干燥箱、蒸汽捕集器、真空泵、冷冻系统。干燥箱可控制温度范围为-40～40℃。 2、流程： 菌种 + 保护剂 菌悬液 安瓿管 洗净 灭菌 预冻 真空冻干 密封 4℃冰箱保存 真空冷冻干燥法 3.操作方法 (1)安瓿管准备：玻璃安瓿管—→2%盐酸浸泡8～10h——洗净—→烘干——加标签——加塞——灭菌。 (2)选择保护剂：