Y遗传性疾病基因治疗的进展_培训课件.ppt

质粒介导转移法 质粒介导转移法是将含有目的基因的重组质粒和某些细胞表面受体能识别的特异性多肽(配体)形成复合物，可通过细胞内吞途径达到转移基因的目的。 例如在体外通过质粒转移凝固因子Ⅷ基因于皮肤成纤维细胞中再植入体内治疗重度A型血友病。 脂质体介导转移法 传统上认为脂质体比病毒运载体有较少的免疫反应,但因转移效果不好，应用受到限制，有通过合成含有整合素基序和DNA结合结构域的多肽提高转移效果的报道。 微粒子轰击法 微粒子轰击法(microparticle bombardment) 利用亚微粒的钨和金能吸附DNA，将它包裹起来形成微粒，通过物理途径(一般应用可调电压产生的轰击波)使它获得很高的速度即基因枪技术，微粒瞬间即可进入靶细胞，达到了转移基因的目的，而又不损伤靶细胞原有的结构。 聚乙烯亚胺介导转移法 聚乙烯亚胺(Polyethylenimine PEI)是线状或支链多阳离子聚合物和DNA形成复合物(PEI-DNA)，PEI-DNA已用于转移DNA到不同组织。 有报道在鼠囊性纤维化模型中，通过喷雾将PEI-DNA传送到肺组织中达到有效的治疗效果。 同源重组法 同源重组法(homologous recombination)是将外源性目的基因定位或原位修补，导入的外源基因和染色体上的基因在同源顺序间发生重组而插入染色体，这样外源基因不是随机地而是专一地整合到靶细胞的特定位点，取代原位点上的缺陷基因。 目的基因的表达 为了使目的基因良好表达，需在重组病毒上加上调控因子如启动子和增强子等，使整合入宿主的基因得到有效表达，产生所需的基因产物。 靶细胞选择 实现基因治疗要从患者体内取出细胞经体外培养、目的基因的转移，然后重新返回人体产生治疗效应。因此，选择靶细胞必须有一定条件，即： 易于取材，自体移植无排斥危险 易于培养和导入基因 移植时不会因细胞老化而影响基因表达 重新植入后，能高速血管化，便于释放外源基因编码的蛋白进入血管。 因此靶细胞选用应该是在体内能保持相当长的寿命或者具有分裂能力的细胞，这样才能使被转入的基因能有效地、长期地发挥“治疗”作用。干细胞、前体细胞都是理想的转基因治疗靶细胞。如ADA缺乏症、珠蛋白生成障碍性贫血、镰状细胞贫血、CGD等都以骨髓细胞作为靶细胞。 除了骨髓以外，肝细胞、神经细胞、内皮细胞、肌细胞、皮肤成纤维细胞、外周血淋巴细胞、也可作为靶细胞来研究或实施转基因治疗。 反义寡核苷酸技术 一些遗传病和肿瘤往往是基因突变或过量表达而产生异常的蛋白质所致，如果应用DNA和RNA的碱基互补，可形成同源和异源双链的原理，将这些突变基因转录的mRNA(DNA)阻断在翻译(或转录)前，使症状得到改善。即人为的制成反义核酸，使其和mRNA互补结合，阻止其翻译成蛋白质而达到治疗疾病的目的。目前常用的就是将人工合成的反义寡核苷酸导入细胞，使它识别并结合到靶mRNA上，从而使之灭活。 下列几种技术可达到治疗的目的： 反义RNA表达载体 反义RNA(或DNA)的体外微注射，即人工合成或通过噬菌体RNA聚合酶产生靶基因的反义RNA，通过微注射入细胞达到抑制靶基因mRNA的目的 用脂质体运送反义RNA，脂质体是由双磷脂膜包围的水相封闭的水泡，反义RNA即溶于其中然后注入体内 其他方法，如利用CaCl2法或细胞打孔仪、逆病毒载体等导入反义RNA或DNA。 安全性问题 安全性问题是基因治疗临床实验前首先要重视的问题。由于基因治疗尚未发展到定点整合以置换缺陷或有害基因的阶段，目的基因在基因组中随机整合有可能激活原癌基因或使肿瘤抑制基因失活，从而引起细胞癌变。 但在实际中遇到下列困难：①输注的酶半减期短，难以持续生效；②注入的酶滞留血浆或组织间隙，难以进入细胞发挥作用；③引起免疫反应而失效或对机体有副作用；④酶制剂难以大量供应。为解决这些困难，目前采用的方法是：（a）酶的诱导。因为有的酶缺乏并非本身结构基因突变，而是由于调节失灵，故通过药物、激素或营养物质可诱导合成缺乏的酶。如苯巴比妥能诱导肝细胞滑面内质网合成葡萄醛酸尿苷转移酶，可防止某些新生儿高胆红素血症；雄性素可诱导α1抗胰蛋白酶合成。 Thank you ! The 1st affiliated hospital of AHMU The 1st affiliated hosp