shRNA对人白血病K562　ADM细胞多药耐药能力的完全逆转论文.docVIP

　　shRNA对人白血病K562　ADM细胞多药耐药能力的完全逆转论文 【摘要】目的研究利用RNA干扰（RNAi）技术来逆转人白血病K562/ADM细胞多药耐药能力的可行性。方法设计两条针对MDR1基因的发夹状RNA（shRNA），并将其分别构建在pGenSil-1质粒中；然后将这两条shRNA分别转染K562/ADM。利用罗丹明外排法、荧光定量PCR来检测这两条shRNA对K562/ADM的多药耐药性的逆转作用。结果在稳定转染的细胞中可以观察到不同程度的MDR逆转现象。在两个稳定转染的克隆中，MDR现象被完全逆转。结论本研究显示可以利用shRNA逆转K562/ADM细胞的多药耐药问题。 【关键词】多药耐药；白血病；shRNA;MDR1 ThepletereversalofmultidrugresistanceinleukemiacellsbyshRNA ZHANGXue-qin,CHENHuan,LIDRidrespectively.Theyycin-resistantK562/ADMcellline.TheRNAieffectsonMDRePCR,andRhodamine123（Rh123）effluxassay.ResultsThestabletransfectedclonesshoonstratesthatMDRcanbereversedbytheshRNA-mediatedRNAiinK562/ADMcells,ultidrug-resistanthepatomacellstoanti-cancerdrugs. 【Keyultidrugresistance;leukemia;shRNA;MDR1 多药耐药（multidrugresistance，MDR）是导致白血病化疗失败和不良预后的重要原因,克服多药耐药的方法之一是使用逆转剂［1］。但临床试验表明，这些药物很难达到一个理想的效果，主要是因为其毒副作用［2］。近年来，随着RNAi技术的发展，利用shRNA完全逆转部分肿瘤细胞的MDR现象已有报道.freelentas公司。 1.2细胞培养细胞在37°C、5%CO2、饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养。培养液为含10%热灭活新生牛血清的RPMI1640细胞培养液。在K562/ADM细胞的培养液中加入浓度为1.0mg/L的阿霉素以维持其耐药性。 1.3siRNA的设计及shRNA的构建利用siRNA设计软件（：.sirna.qiagen.）设计了两条序列，分别针对MDR1基因（accessionnumber:M14758）的不同编码区域。MDR-A:5′-AACTTTGGCTGCCATCATCCA-3′;MDR-B:5′-AAGGCCTAATGCCGAACACAT-3′,分别针对MDR1mRNA的第586-606及第3494-3514核苷酸区域。这两个序列分别被构建到一段短的双链DNA序列中（武汉晶赛公司合成，表1）。目的序列作为反义链，其正义链与反义链互补，中间间隔一段长9个核苷酸的发夹环，两端分别插入终止序列及HindⅢ或BamH1酶切位点。然后将这两个序列分别插入pGenSil-l（武汉晶赛公司,图1）质粒中。反应按武汉晶赛公司建议的操作流程进行。 表1shRNA寡核苷酸片断的序列 （略） 图1pGenSil-l质粒的结构。pGenSil-l质粒 （略） 1.4细胞转染及稳定转染克隆的筛选当K562/ADM细胞在六孔板内达到50%~60%满时进行转染。具体操作步骤按Lipofectamine2000TM说明书建议的操作步骤进行。细胞转染48h后，将细胞转入直径10cm的培养板中并加入含400μg/mlG418的培养液（不含阿霉素）进行培养。3周以后，将稳定转染的克隆挑入96孔板中并扩增。期间利用荧光显微镜进行观察，稳定转染的克隆发绿色荧光；而没有稳定转染的细胞没有绿色荧光，丢弃这一部分细胞。 1.5P-gp泵功能检测为了观察转染细胞的RNAi效果,.freela,MO,USA）外排法来检测转染细胞的P-gp泵功能，具体操作方法如Broxterman等［3］所述。简而言之，当细胞在6孔板内达到70%~80%满时，加入Rh123，其在培养液中的作用浓度为0.20μg/ml，37°C孵育1h，然后将细胞用4°CPBS漂洗3遍后重悬于4°CPBS中，细胞浓度为5~10×105/ml。上流式细胞仪（Bectondickinsonimmunecytometrysystems）检测10000个细胞内的Rh123荧光强度。激发波长为488nm。每次试验时利用没有加入Rh123的K562细胞作为空白对照。通过计算在M1区域细胞的百分比来鉴定细胞的P-gp泵功能，落在该区域细胞的百分比越高，则该