人bax基因逆转录病毒表达载体的构建及其在Hela细胞中的表达论文.docVIP

　　人bax基因逆转录病毒表达载体的构建及其在Hela细胞中的表达论文 陈秀军 程玉峰 王来城 【摘要】 ［目的］构建带有报告基因EGFP的bax基因逆转录病毒表达载体，建立高表达bax基因的Hela细胞。［方法］通过RTPCR方法从Hela细胞克隆bax基因，根据基因工程原理，经PCR、酶切等方法构建bax基因和报告基因EGFP双基因逆转录病毒表达载体pLBaxSNIRES2EGFP，转染Hela细胞后，荧光显微镜和BI产品；兔抗人Bax一抗、羊抗兔HRP标记IgG二抗为Santa Cruz公司产品；pMD18T载体为大连宝生物公司（TaKaRa Dalian）产品；其它试剂购自上海生物工程公司（Sangon）产品。 1.2 细胞培养 PA317细胞以DMEM培养基培养，Hela细胞以RPMI 1640培养基，置37oC、5%CO2环境下培养。培养基内含10%新生牛血清、青霉素100U/ml和链霉素100μg/ml。 1.3 实验技术路线 如图1所示。 1.4 引物设计 根据GenBank数据库（.ncbi.nlm.nih.gov/）得到bax基因cDNA序列（收录号：NM_138761）及其相关信息，采用Oligo 6.0软件设计bax引物，序列如下：上游P1 5′GAGAATTCATGGACGGGTCCGGGGAG 3′，下游P2 5′GTCTCGAGCCTCAGCCCATCTTCTTC3′，P1人为引入EcoRⅠ酶切位点，P2引入XhoⅠ酶切位点，其PCR扩增产物预计在597bp，包含bax基因整个开放阅读框（Open Reading Frame, ORF）。另外，为了从pIRES2EGFP载体上引出IRES2EGFP基因序列，又设计了一对引物P3、P4和测序引物P5，序列如下：上游P3 5′GTATCTCGAGATTAAGATCTTCCGCCCCTCTCCCTCCCCCCC3′、下游P4 5′CGGGATCCTTTACTTGTACAGCTCGTCCAT3′、P5 5′ATG GTGAGCAAGGGCGAGGAG 3′。P3引入XhoⅠ酶切位点， P4引入BamHⅠ酶切位点，扩增产物预计为1346 bp。 1.5 bax基因克隆及鉴定 采用异硫氰酸胍一步法从培养Hela细胞中提取总RNA，取1μg总RNA，按照MMLV逆转录酶操作说明书，转录成cDNA第一链，取2μl做模板，P1、P2为引物进行PCR扩增，反应体系：P1、P2各0.5μM、2.5UPfu DNA聚合酶、200μM dNTP、1×PCR Buffer，50μl反应体系；反应条件：94oC预变性10min，94oC变性30s、52oC退火45s、72oC延伸60s共35个循环，再向PCR反应管中加入1.25U Taq DNA聚合酶，72oC终末延伸15min，使扩增产物5′端加A，以方便TA克隆。50μl PCR产物跑制备电泳，胶回收纯化PCR产物，按照pMD18T载体说明书进行TA克隆，转化感受态DH5α，涂布LB+Amp抗性平板，菌落PCR筛选、酶切初步鉴定阳性重组质粒pMDbax，然后用ABI BigDye 3.1测序试剂盒、M13通用引物做测序PCR，在ABI Prism 3100Avant遗传分析仪上做测序鉴定。 1.6 IRES2EGFP基因序列获得及鉴定 取10ng pIRES2EGFP载体做模板，P3、P4为引物进行PCR扩增，反应体系：P3、P4各0.5μM、2.5 U Pfu DNA聚合酶、200μM dNTP、1×PCR Buffer，50μl反应体系；反应条件：94oC预变性10min，94oC变性30s、60oC退火45s、72oC延伸90s共30个循环，再向PCR反应管中加入1.25 U Taq DNA聚合酶，72oC终末延伸15min。TA克隆、阳性重组质粒筛选、测序鉴定同上，除用M13通用引物外，还用P5引物测序，将1 346bp长度的DNA序列测通，将其重组质粒命名为pMDIRES2EGFP。 1.7 pLXSNIRES2EGFP表达载体构建及鉴定 用XhoⅠ和BamHⅠ双酶切测序鉴定正确的pMDIRES2EGFP重组质粒，跑1％琼脂糖凝胶电泳，胶回收纯化1 350bp左右的条带，此为两端带XhoⅠ和BamHⅠ位点的IRES2EGFP基因序列。同样，用XhoⅠ和BamHⅠ双酶切pLXSN载体质粒，胶回收纯化5.9kb的线性化的载体，其两端同样带有XhoⅠ和BamHⅠ位点。用DNA Ligation Kit将IRES2EGFP基因序列通过XhoⅠ和BamHⅠ位点定向与线性化的pLXSN载体连接，连接时其摩尔数之比控制在4:1左右。转化、筛选同上。最后XhoⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定。此载体命名为pLX