人CTLA4Ig基因重组腺病毒载体的构建及鉴定论文.docVIP

　　人CTLA4Ig基因重组腺病毒载体的构建及鉴定论文 【摘要】 目的： 用AdEasy腺病毒载体系统构建CTLA4Ig重组腺病毒，以感染树突状细胞使其递呈抗原至T淋巴细胞功能受阻. 方法： 双酶切、凝胶回收方法从质粒pCDM8CTLA4Ig提取目的基因CTLA4Ig，构建成腺病毒穿梭质粒pAdTrackCTLA4Ig；经酶切线性化后的pAdTrackCTLA4Ig与AdEasy1进行同源重组，经酶切线性化转染入HEK293细胞进行包装. 结果：卡那霉素抗性筛选和PacⅠ酶切确证重组腺病毒质粒pAdCTLA4Ig, PacⅠ酶切产生30 kb和4.5 kb 2个片断为同源重组. 重组腺病毒质粒经293细胞包装后可观察到绿色荧光，收获病毒并制备出高滴度重组腺病毒（病毒滴度为1.6×109）. 结论： 成功构建了携带CTLA4Ig基因的重组腺病毒载体，为利用CTLA4Ig基因转染树突状细胞的基因治疗奠定了基础. 【关键词】 CTLA4Ig基因；腺病毒科；遗传工程 【Abstract】 AIM: To construct rebinant adenovirus vector carrying the human cytotoxic lymphocyte antigen 4 immunoglobulin (CTLA4Ig) gene and amplify the adenovirus vector in HEK293 cells, and then to infect dendritic cells to block the submission of antigen from dendritic cells to T lymphocytes. METHODS: CTLA4Ig gene e site pCDM8CTLA4Ig vector, then subcloned into the shuttle plasmid pAdTrackCMV after digested by the same enzyme. The rebinant plasmid pAdTrackCTLA4Ig linearized by PmeI, ically transfected into E. coli BJ5183 cells that had been chemically transfected id pAdEasy1. Finally, the linearized rebinant plasmid ycin resistence and confirmed by PacI. The restrictive endonuclease analysis confirmed that correct rebinant adenovirus plasmid ents phocyte antigen 4 immunoglobulin, CTLA4Ig），与树突状细胞表面分子B7结合，即可阻断T细胞表面分子CD28与B7结合，降低T细胞的活化，则可能阻断过敏反应产生. 本研究拟构建可转染树突状细胞的表达CTLA4Ig的腺病毒体系［2-3］. 1材料和方法 1.1材料 质粒pCDM8CTLA4Ig(HindⅢ, XbaⅠ)（第三军医大学烧伤外科研究所罗高兴博士惠赠），穿梭质粒pAdTrackCMV及骨架质粒pAdEasy1（芝加哥大学TC. He博士惠赠），大肠杆菌BJ5183、DH5α（重庆医科大学病毒性肝炎研究所），PCR试剂盒,DNA Ligation Kit 试剂盒、限制性内切酶HindⅢ,.freeleⅠ（NEB公司），LipofectamineTM 2000（Invitrogen 公司），PCR引物由上海鼎安生物技术有限公司合成，CTLA4Ig引物序列为上游：5′ATGGGTGTACTGCTCACACAG3′；下游为：5′TCATTTACCCGGAGACAGG3′. 1.2方法［4］ 1.2.1双酶切法质粒pCDM8CTLA4Ig被在大肠杆菌中扩增后，以HindⅢ和XbaⅠ双酶切获与理论片断相符的CTLA4Ig片断，用凝胶回收试剂盒回收；腺病毒穿梭质粒载体pAdTrackCMV被HindⅢ和XbaⅠ双酶切后呈开环状，在16℃下与回收的CTLA4Ig片断经DNA Ligation Kit连接. 连接后产物被转化至大肠杆菌DH5α，提取的质粒pAdTrackCTLA4Ig以HindⅢ和XbaⅠ双酶切后鉴定. 1.2.2转化将骨架质粒pAdEasy1转化至BJ5183, 并制备BJ AdEasy1的感受态，经PmeⅠ单酶切的pAdTrackCTLA4Ig加入BJAdEasy