人EPO基因真核表达载体的构建及其在人脐血间充质干细胞中的表达论文.docVIP

　　人EPO基因真核表达载体的构建及其在人脐血间充质干细胞中的表达论文 夏桂枝，张国成，陈新民，洪新如 【摘要】 目的： 构建人EPO基因真核表达载体并转染人脐血间充质干细胞，获得稳定表达人EPO的人脐血间充质干细胞. 方法： 从人胎肝细胞中提取总RNA，经过RTPCR方法扩增人EPO全长cDNA，应用基因重组技术将EPO cDNA基因亚克隆至pcDNA3真核表达载体内，以酶切和测序方法鉴定重组质粒pcDNA3-EPO构建的正确性.freelan EPO gene and explore its expression in mesenchymal stem cells (MSCs) derived from human umbilical cord blood (UCB). METHODS: The total RNA human fetal liver cells. EPO cDNA plication and subcloned into pcDNA3 vector to construct rebinant pcDNA3-EPO plasmid. After identified by restriction enzyme analysis and sequencing,the pcDNA3-EPO an UCB-derived MSCs mediated by lipofectamine and the expression of exogenous EPO ined by RT-PCR,SCs. CONCLUSION: The rebinant pcDNA3-EPO an EPO cDNA is successfully constructed and human UCB-derived MSCs esenchymal stem cells; transfection 0 引言 近年研究发现促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）具有神经营养、神经保护和促进神经发育的作用，在脑组织损伤尤其是新生儿缺氧缺血性脑损伤中发挥着重要作用［1］. 间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是近年发现的一种具有多向分化潜能的成体干细胞［2］，而且是外源基因良好的细胞载体［3-4］. 我们构建人EPO基因真核表达载体，将其转染人脐血MSCs，观察EPO在人脐血MSCs中的表达情况，以探索EPO基因修饰的人脐血MSCs用于移植治疗新生儿缺氧缺血性脑病（hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE）的可行性. 1 材料和方法 1.1 材料 人胎肝细胞系L02，质粒pcDNA3由福州总医院实验科王水良博士惠赠. 菌种E. coli DH5α为福州总医院实验科保存. RT-PCR反转录试剂盒（Promega公司）；DNA胶回收试剂盒（上海华尧核酸技术有限公司）；质粒抽提纯化试剂盒（Qiagen公司）；EcoRⅠ，XhoⅠ限制性内切酶，dNTP，Taq酶，T4 DNA连接酶，DNA分子质量Marker DL2000，DL15000（TaKaRa公司）；LipofectamineTM 2000，Trizol（Invitrogen公司）；MSCs培养基MesencultTM（Stem cell公司）；兔抗人EPO抗体、HRP-羊抗兔IgG， Plus试剂盒（北京中杉生物技术公司）. 1.2 方法 1.2.1 EPO cDNA的合成 参照Trizol说明书抽提人胎肝L02细胞总RNA，反转录为人胎肝细胞总cDNA，以反转录产物为模板，PCR法扩增EPO cDNA. PCR引物根据Genbank中登录的EPO cDNA 全长序列设计两对引物. 扩增EPO cDNA全长序列上游引物： 5′-atgaattcatgggggtgcacgaatgtcc-3′，下划线部分为EcoRⅠ酶切位点，下游引物：5′-gcctcgagtcatctgtcccctgtcctgc-3′，下划线部分为XhoⅠ酶切位点；预期扩增片段长582 bp. RT-PCR法鉴定EPO在人脐血MSCs中表达的上游引物为：5′-tcatctgtgacagccgagtc-3′，下游引物为：5′-cactgacggctttatccaca-3′，预期扩增片段长288 bp. 均由上海生工生物工程公司合成. PCR反应体系如下：总体积为50 μL，10×PCR缓冲液5 μL，dNTP混合液4 μL，待扩增的模板（人胎肝细胞总cDNA）6 μL，上游引物（20 μmol/L）0.5 μL，下游引物（20 μmol/L）0.5 μL，DNA聚合酶1 μL，dd H2O 33 μL. 94℃预变性5 min，94℃