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人FLT3配体的克隆、表达与纯化论文.doc
人FLT3配体的克隆、表达与纯化论文
.freelolecular;gene expression;protein purification
Abstract:AIM To clone human FLT3ligand gene，express FL protein in E.coli and purify it preliminarily.METHODS A cDNA encoding soluble FL the total RNA extracted from human peripheral blood mononuclear cells and identified by analyzing the nu-cleotide sequences.The human FL gene id pRSET-B-FL ed to BL21（DE3），and then FLT3ligand ent of IPTG.The fused protein ethods of SP-Sepharose Fast Floployed to identify the ex-pression of human FLT3ligand.RESULTS FL gene human peripheral blood mononuclear cells.Sequence analysis revealed the sequence of FL gene e digestion of EcoRⅠand HindⅢenzyme.SDSshoethod plification.The expressing vector of FL inari-ly.The study HⅠ，HindⅢ内切酶、T4DNA连接酶、逆转录酶、RnaseH，oligo（dT）12-18 ，DNA marker、蛋白marker，NucleoTrap Gel Extraction试剂盒、测序试剂盒均为Takara公司产品.SP-Sepharose FF及Q-Sepharose FF购自Pharmacia公司.DTT为Serva公司产品.pGEM-3ZF（-）克隆质粒和表达质粒pRSET-B均为本教研室保存，其余试剂为国产分析纯.
1.2 方法
1.2.1 反转录cDNA第1链 取健康人外周血，分离单个核细胞［5］ .提取总RNA.总RNA5μg加oli-go（dT）
12-18 0.5μg，以DEPC处理水补足体积至25μL，于70℃水浴放置10min，然后迅速转移至50℃;向上述样品中加入25μL42℃预热的反应混合物（DEPC处理水7.5μL，10×PCR缓冲液5μL，25mmol L-1 MgCl2 5μL.10mmol L-1 4×dNTPs2.5μL，0.1mol L-1 DTT5μL）和3.3μkat逆转录酶，50℃水浴孵育50min;70℃水浴15min终止反应后，将样品置于冰上冷却，然后加入RNaseH并移至37℃水浴孵育20min.
1.2.2 巢式PCR扩增FLcDNA 外侧引物1，5’端引物:5’--3’cg gaa ttc gag act tgt tct tct gtc cc;3’端引物:5’--3’cg gga tcc tca gtg ctc cac aag cag c;内侧引物2，5’端引物:5’--3’cg gga tcc aac ggc acc cag gac tgc tcc ttc;3’端引物:5’--3’cgt aag ctt cta tgt cgg ggc tgt ggc ctc.取1μL FLcDNA为模板，加入10×PCR缓冲液5μL，25mmol L-1 MgCl2 5μL.25mmol L-1 4×dNTPs1μL，25μmol L-1 外侧引物各1μL，用水补足体积至50μL，上覆石蜡油.95℃预变性5min后，加TaqDNA聚合酶，94℃60s，55℃60s，72℃60s.扩增30个循环.取第1轮PCR扩增产物1μL为模板，加入内侧引物进行第2轮PCR扩增（其他成分同上）.94℃60s，55℃60s，72℃60s.扩增30个循环.
1.2.3 重组pGEM-3zf（-）-FL的构建 取纯化后经 EcoRⅠ，BamHⅠ双酶切的FL基因片段60ng，纯化后经EcoRⅠ，BamHⅠ双酶切的pGEM-3zf（-）质粒20ng，T4DNA连接酶1μL，T4DNA连接酶10×缓冲液1μL，用水补足体积至10μL，16℃连接12h，以5μL连接产物转化100μL大肠杆菌JM109感受态细胞，挑取转化皿上生长的单菌落，扩大培养后提取质粒，用EcoRⅠ，BamHⅠ限制酶进行酶切鉴定.
1.2.4 DN
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