人granzyme B基因在HeLa细胞中的表达论文.docVIP

　　人granzyme B基因在HeLa细胞中的表达论文 .freele B;基因表达;HeLa细胞 摘 要:目的 构建携带人granzyme B基因的真核表达载体，并将其在HeLa细胞中表达. 方法 用反转录PCR获取人granzyme B全长cDNA序列，将其活性型序列克隆进pcD-NA3重组表达质粒.脂质体法转染HeLa细胞，间接免疫荧光检测目的蛋白表达，HE染色观察其对转染HeLa细胞形态的影响. 结果 成功获得了野生型granzyme B cDNA，构建了编码活性型granzyme B的真核表达载体pcDNA3-G.转染HeLa细胞后观察到目的蛋白表达，转染细胞形态发生变化，出现多核大细胞及固缩小细胞. 结论 活性型granzyme B哺乳动物表达系统的建立.freele B的生物学效应奠定了基础. Keye B;gene expression;HeLa cells Abstract:AIM To construct eukaryotic expression vector carrying human granzyme B gene and express it in HeLa cells.METHODS RT-PCR an granzyme B cDNA.Then the rebinant expression vector pcDNA3-G e B into eukaryotic expression vector pcDNA3.After transfection into HeLa cells through lipofectamine2000 TM ，the expression of target gene munofluorescence as-say and its effect on HeLa cells an granzyme B cDNA e B e transfected cells greultiple nuclei，.CONCLUSION The establishment of mammalian expression system of active granzyme B is of significance in further research for granzyme B. 0 引言 granzyme B，即颗粒酶B，是杀伤性T淋巴细胞（CTL）和自然杀伤（NK）细胞颗粒（granule）中最重要的丝氨酸蛋白酶，在颗粒介导的靶细胞凋亡中起关键作用［1，2］ .它最初以酶原形式合成，在内质网中加工除去N端信号肽后，贮存于CTL的颗粒中.当CTL接受抗原刺激时，granzyme B被切除N端酸性二肽，成为活性型granzyme B［3］ .活性型granzyme B通过穿孔素或受体进入靶细胞，广泛切割含Asp-X，Glu-X位点的多种底物蛋白，引起细胞凋亡［4-8］ .目前对其促凋亡功能的研究局限于纯化granzyme B天然或重组蛋白，或分离表达granzyme B的CTL，体外与靶细胞孵育.我们克隆获得了人granzyme B全长cDNA序列，并将活性型序列转染HeLa细胞，观察表达产物对转染细胞的直接效应. 1 材料和方法 1.1 材料 pUC19质粒、pcDNA3质粒、E.coli DH5α宿主菌和人宫颈癌细胞系HeLa均为本室保存;淋巴细胞分离液为华美公司产品;PHA-P购自Sigma公司;限制性内切酶、Taq酶、反转录试剂盒、RPMI1640，DMEM，新生牛血清及脂质体lipofec-tamine2000TM 均购自Gibco公司;T4 DNA连接酶为TaKaRa产品;plasmid purification kit购自上海华舜公司;山羊抗人granzyme B多克隆抗体为Santa Cruz产品;生物素化兔抗山羊二抗及SABC-Cy3为博士德产品;测序试剂盒购自PE公司. 1.2 方法 1.2.1 人granzyme B cDNA的获取及克隆 用淋巴细胞分离液分离健康人外周血单个核细胞，0.015g L-1 PHA-P刺激培养72h，加Trizol试剂提取总RNA.设计引物GRBF，GRBR，序列如下.GRBF为:5’-TTTGGATCCATGCAACCAATCCTGCT-TCT-3’;GRBR为:5’-TTTGAATTCTTAGTA-GCGTTTCATGGTTT-3’.以GRBR为引物，按试剂盒说明书反转录出cDNA第一链，用GRBF和GRBR引物PCR得到granzyme B双链cDNA.BamHI，EcoRI双酶切PCR产物及pUC19质粒，连接、转化入E.coli DH5α，酶切鉴定后测序，重