人Era和人Era C端蛋白在大肠杆菌中的高表达论文.docVIP

　　人Era和人Era C端蛋白在大肠杆菌中的高表达论文 .freelanEra;humanEraC-terminaldomain;Es-cherichia.coli;geneexpression Abstract:AIMTohighlyexpresshumanEra（h-Era）andh-EraC-terminaldomainproteininE.coli.METHODSHu-manera（h-era）cDNAandh-eracDNAC-terminaldomaingeneplifiedbyPCRbyusingaplasmidcontainingh-eracDNAasatemplate，andligatededidpRSET-C-h-eraedidpDH-h-era-Cinaldomainprotein.Theexpressionproductsatography-scanning.RESULTStheexpressed（His）6-h-Erafusionproteininaldomainproteininaldomainproteinhadbeensuc-cessfullyhighlyexpressedinE.coli. 0引言 era基因首先在大肠杆菌中被发现，最早由于其编码的氨基酸序列与人及酵母的RAS蛋白有部分相似之处，命名为E.coliRas-like（era）基因［1］.但其后仔细分析，纠正了最初发表序列中的部分错误，并注意到仅EraN端的序列与Ras相似，Era并不属于Ras家族［2］.大肠杆菌era基因的同源基因广泛存在于原核生物中，在蠕虫、小鼠、和人以及金鱼草（An-tirrhinum）等真核生物中，也存在与细菌era高度同源的基因［3-5］.era基因编码的Era蛋白能特异地与鸟苷酸结合，具有GTP酶活性［2，6］.Era蛋白N端为GTP结合区，与真核Ras蛋白中GTP结合区的氨基酸序列有显著的同源性;C端与真核Ras蛋白及其它G蛋白均无同源性，为Era所特有的保守区，其中含有VIGxxGxxIK序列，该序列是与RNA结合的KH结构域的保守序列［7］.实验证明Era蛋白可与大肠杆菌16SrRNA结合，C端的缺失的Era蛋白不能与16SrRNA结合，失去其生物功能［8］.因此Era是一类有别于RAS的新的G蛋白.era基因与细菌细胞周期和细胞分裂有关，是细菌生存繁殖所必需的重要基因，它对细菌细胞周期的作用点在染色体分裂之后、细胞质分裂之前［3］.在真核细胞中，era基因也具有重要的作用.金鱼草中era的同源基因erg的缺失突变可使植物胚胎的发育受阻［5］人era基因的全长cDNA于1998年被克隆，与原核era基因具有很高的同源性.人Era蛋白与大肠杆菌Era蛋白的氨基酸序列有30%相同，两者的相似性为53%［4］.人era基因的功能尚不清楚.我们采用基因工程手段，在大肠杆菌中高表达了人Era和EraC端蛋白，为制备抗人Era抗体，研究人Era和EraC端蛋白的理化特性，阐明人era基因功能打下了基础. 1材料和方法 1.1材料 克隆有h-era全长cDNA的质粒pBS-h-era由陈苏民教授提供;（His）6融合表达载体pRSET-C购自Invitrogen公司;表达载体pDH由本实验室在pBV220的基础上构建.E.coliTAP106和E.coliBL21（DE3）由本实验室保存提供.Taq酶、Klenoa公司.蛋白电泳系统为Bio-Rad公司产品.DNA测序仪为PE公司ABI377型.薄层扫描仪CS-9000为岛津公司产品.1.2方法 1.2.1PCR扩增h-era 全长cDNA和其C端区域基因以pBS-h-era质粒为模板，用引物1和引物3扩增h-era全长cDNA，用引物2和引物3扩增h-eracDNAC端区域基因.PCR反应条件均为:94℃45s，58℃45s，72℃60s，共30个循环.PCR引物序列:引物1:5′-AAGGATCCATGBamHⅠ AATAGAGATGAACAAGATGTTCTCTTG-3′;引物2:5′-AAATGAAGCTTAAGATGAGACAGGCATTCCAC-3′;引物3:5′-AACTGCAGTTATCPstⅠACTTGAGGAGCTTC-3′ 1.2.2重组表达质粒的构建 h-era全长cDNA的PCR产物和表达载体pRSET-C用BamHⅠ和PstⅠ酶切后连接，以连接产物转化感受态BL21（DE3）菌.h-eracDNAC端区域基因PCR产物用PstⅠ酶切，表达载体pDH用EcoRI酶切后，用KlenoL L-1转接于上述LB培养基中，32℃振荡培养至A600nm为0.6，转入42℃振荡