人CCR5Delta32基因的克隆及其重组慢病毒载体的构建　论文.docVIP

　　人CCR5Delta32基因的克隆及其重组慢病毒载体的构建　论文 安群星，穆士杰，张献清，陈蕤，张颖，余瑞，刘宁 【摘要】 目的：克隆人CCR5Delta32基因并构建含目的基因的重组慢病毒载体pLentiCCR5Delta32，用于获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的基因治疗研究. 方法：从CCR5Delta32突变个体外周血单个核细胞（PBMCs）内提取人基因组DNA.freelT载体连接，随后转化感受态E.coli DH5α，提取质粒进行酶切鉴定及DNA测序. 再将鉴定正确的CCR5Delta32基因亚克隆至慢病毒载体pLenti6/V5DTOPO并进行酶切鉴定及DNA序列分析. 结果：经PCR扩增获得约650 bp的DNA片段，测序结果与GenBank上的序列完全一致，克隆的目的基因已经正确插入到慢病毒载体pLenti6/V5DTOPO中. 结论：成功克隆了人CCR5Delta32基因并构建了含目的基因的重组慢病毒载体pLentiCCR5Delta32，为进一步AIDS基因治疗研究奠定基础. 【关键词】 人CCR5Delta32基因；基因克隆；慢病毒载体；HIV感染；AIDS 【Abstract】 AIM: To clone human CCR5Delta32 gene and construct the rebinant lentiviral vector pLentiCCR5Delta32 for the further gene therapy of AIDS. METHODS: Fulllength CCR5Delta32 gene plified by using PCR from human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) genomic DNA, and then cloned into pUCmT. After sequence analysis, the CCR5Delta32 gene ent of 650 bp ity an CCR5Delta32 gene is cloned correctly and the rebinant lentiviral vector pLentiCCR5Delta32 is constructed successfully, and all these lay a foundation for further studying the gene therapy of AIDS. 【KeyT载体和pLenti6/V5DTOPO载体（Invitrogen公司）；基因组DNA提取试剂盒（QIAGEN公司）；胶回收试剂盒（宝信公司）；质粒快速提取试剂盒（Promega公司）；Taq DNA聚合酶,T4 DNA连接酶以及限制性内切酶EcoRI, BamH I和Pst I（TaKaRa公司）. 1.2 方法 1.2.1 外周血基因组DNA的提取 按QIAamp Blood Kit说明书提供的操作步骤进行. 取CCR5Delta32突变个体外周静脉抗凝血约200 μL（标本来自解放军第302医院住院患者），加入蛋白酶K和裂解缓冲液，振荡混匀，70℃温育10 min. 之后加入无水乙醇，振荡混匀后将其加入到QIAamp spin柱内，用清洗缓冲液洗涤柱子2次，最后用预热的洗脱缓冲液洗脱柱内的基因组DNA. 1.2.2 PCR引物设计与合成 根据GenBank中的CCR5Delta32基因序列设计引物如下：上游5′ GAATTCGCCACCATGGATTATCAAGTGTCAAGTC 3′，下游5′ GAATTCTCATTTCGACACCGAAGC 3′. 引物由上海生工生物工程技术有限公司负责合成. 1.2.3 目的基因的扩增 以人外周血单个核细胞（PBMCs）基因组DNA为模板，利用上述引物通过PCR技术扩增目的基因片段. 反应体系：PBMCs基因组DNA 4 μL，10×PCR Buffer (Mg2+ plus) 5 μL，dNTP Mixture (各2.5mmol/L) 4 μL，引物（20μmol/L）各2 μL，Taq酶(5×106 U/L) 0.5 μL，最后加水至终体积50 μL. 反应条件：94℃预变性5 min，然后按94℃ 30 s，55℃ 50 s，72℃ 1 min扩增30个循环，最后72℃延伸10 min. 取15 μL PCR产物进行12 g/L琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的片段. 1.2.4 目的基因的克隆与鉴定 用EcoRI单酶切PCR产物及pUCmT载体，胶回收后用T4 DNA连接酶连接，随后转化E.coli