人CD14转基因细胞系的建立论文.docVIP

　　人CD14转基因细胞系的建立论文 .freelent of Murine Cell Line Transfected an CD14 Gene Abstract This study ed to construct the CD14 eukaryotic expression vector，establish the transgeneic CD14 positive cell line in order to facilitate the establishment of a mouse model of antibody targeting therapy for human acute monocytic leukemia (AML-M5). Total RNA extracted from peripheral blood mononuclear cells an CD14 gene urine melanoma cell line B16 an CD14 on the transfectant ed by floetry (FCM).The results indicated that the sequence of the human CD14 cDNA cloned e as the one from GenBank database.The rebinant pcDNA3.1(+)/CD14 e cleaving.The expression of the human CD14 on the transfectant (B16/CD14) ed by FCM.In conclusion，the murine cell line B16/CD14 fransfected an CD14 gene has been established an AML-M5 antibody targeting therapy ouse model. Key onocytic leukemia; mouse model 急性单核细胞白血病（AML-M5）是难治性白血病之一，CD14是M5细胞膜上的特异性标志，它在其它细胞成分包括T、B、自然杀伤细胞(NK)、红细胞、血小板、造血干/祖细胞以及非造血系统细胞上不表达［1］，并且单核细胞能通过CD14将与CD14抗原分子结合的分子内吞入细胞内［2］，因此CD14是导向治疗AML-M5的良好靶点。本研究组已经将自制鼠源性抗人CD14单克隆抗体（ZCH-7-2F9）研制成基因工程抗体，拟进一步进行动物试验。为了建立良好的动物模型，一个稳定表达人CD14抗原分子的肿瘤细胞系是重要的环节。然而，除病人新鲜M5细胞外，国际上很少有CD14表达的单核细胞系存在，从而对该研究的深入进行带来困难。目前，大多数研究室仍然通过VitD3诱导单核细胞来源的细胞株U937 来获得CD14阳性表达的细胞系［3］，这不仅不能保证CD14表达的均一性，也不利于人M5白血病动物模型的建立及其体内导向治疗的研究，通过转基因技术建立表达人CD14抗原的鼠肿瘤细胞系是解决这一问题的可行途径。为此，我们利用C57BL/6小鼠黑色素瘤细胞B16的高效转染性，初步建立人CD14抗原阳性表达的鼠细胞系B16/CD14，为CD14阳性白血病动物模型的建立奠定了基础。 材料和方法 标本、主要试剂及仪器 单核细胞来自正常人外周血，进口直标单克隆抗体CD14-PE、γ1-FITC、γ1-PE为美国Becton Dickinson公司产品；2F9-FITC为本实验室研制的直标鼠抗人CD14单克隆抗体试剂；TrizoL液、高保真度Taq DNA 聚合酶、Loega公司；QIAquick DNA 纯化试剂盒购于Qiagen公司； RPMI 1640培养基、EcoRI、HindⅢ和XbaⅠ内切酶及G418购于Gibco BRL公司；全自动测序仪（ABI PRISM377）为P-E公司仪器；FACSCabliburTM流式细胞仪购自美国Becton Dickinson公司；哺乳动物表达载体pcDNA 3.1 (+ ) 购自Invitrogen 公司。 细胞株及受体菌 C57BL/6黑色素瘤细胞B16冻存于浙江大学附属邵逸夫医院中心试验室；大肠 杆菌DH5α由曹江博士惠赠。 引物 根据NCBI GenBank检索的人CD14 cDNA序列设计上下游引物，分别含有HindⅢ 和XbaⅠ酶切位点，委托上海生物技术工程有限公司合成： 上游引物为：5′ A↓AGCTTATGGAGCGCGCGTCCTGCTTGTTGCTG 3′ （HindⅢ），下游引物为：5′ T↓CT AGATTAGGCAAAGCCCCGGGCCCCTTGGA