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　　人CD59 RNAi逆转录病毒载体系统的构建与鉴定论文 石学香高美华臧金林 【摘要】目的利用siRNA表达载体法构建并筛选携带针对CD59基因pSUPERretroRNAi逆转录病毒载体及稳定产毒的细胞克隆。方法用DNA重组技术，将3条60bp能转录产生靶向CD59小发夹RNA（shRNA）的寡核苷酸序列定向克隆入逆转录病毒载体pSUPERretro，脂质体法转染包装细胞系PhoenixA，建立产生逆转录病毒的细胞克隆。结果重组载体经PCR及限制性内切酶酶切鉴定初步成功后测序序列正确；重组载体转染包装细胞，可表达绿色荧光蛋白，表明包装成功。结论特异性沉默CD59基因的pSUPERretroRNAi逆转录病毒载体以及稳定产毒的细胞系构建成功，为后续进行肿瘤细胞的研究奠定了基础，可望为肿瘤治疗开辟新途径。 【关键词】RNA,双链；抗原,CD59；转染；逆转录病毒载体 CD59是补体终末段的一种调节蛋白.freelentas公司；E.Z.N.A.GelExtractionkit购自美国OMEGA公司。 1.2方法 1.2.1靶向CD59基因寡核苷酸的设计应用美国OligoEngine公司提供的双链RNA（siRNA）设计软件，将CD59的基因序列号输入后，通过Blast搜索确认与人的基因序列无同源性，选出3条序列（分别为218～236bp，261～279bp，318～336bp）作为实验组。按照pSUPER质粒说明书中构建发夹状短链RNA的原则，设计序列分别为：T1组，5′GATCCCCGCGTGTCTCATTACCAAAGTTCAAGAGACTTTGGTAATGAGACACGCTTTTTA3′，As:5′AGCTTAAAAAGCGTGTCTCATTACCAAAGTCTCTTGAACTTTGGTAATGAGACACGCGGG3′；T2组，5′GATCCCCGTGTTGGAAGTTTGAGCATTTCAAGAGAATGCTCAAACTTCCAACACTTTTTA3′，As:5′AGCTTAAAAAGTGTTGGAAGTTTGAGCATTCTCTTGAAATGCTCAAACTTCCAACACGGG3′；T3组，5′GATCCCCTGAGCTAACGTACTACTGCTTCAAGAGAGCAGTAGTACGTTAGCTCATTTTTA3′,As:5′AGCTTAAAAATGAGCTAACGTACTACTGCTCTCTTGAAGCAGTAGTACGTTAGCTCAGGG3′。同时设计一段错义的19nt作为对照:C组，5′GATCCCCAGACTTGACTCCTGTCGAATTCAAGAGATCTGAACTGAGGACAGCTTTTTTTA3′，As:5′AGCTTAAAAAAGACTTGACTCCTGTCGAATCTCTTGAATCTGAACTGAGGACAGCTTGGG3′。 1.2.2重组载体的构建本研究选用美国OligoEngine公司的pSUPERretroneo+gfp质粒作为载体，该载体有BglⅡ和HindⅢ两个酶切位点，两位点之间为长983bp的填充序列，将该填充序列切下后，与上述合成的具有BglⅡ和HindⅢ黏性末端的60nt的寡核苷酸双链连接，构成重组质粒。 1.2.3重组载体的鉴定PCR初步验证重组载体的正确性，设计一对引物，扩增产物为包括插入序列及其两侧部分碱基的一段长度为395bp的核苷酸，引物序列如下:pSUPERa:5′CCTTTATCCAGCCCTCACTC3′，pSUPERs:5′AGACTGCCTTGGGAAAAGCG3′。分别以重组质粒pSUPERsiCD59及空质粒为模板进行PCR反应。阳性克隆可观察到长为395bp条带，而空质粒可观察到长1318bp条带。用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切重组质粒pSUPERsiCD59以及对照空质粒，37℃水浴过夜，次日各取10μL于10g/L的琼脂糖凝胶中电泳，在凝胶成像系统中观察电泳结果。阳性克隆可观察到长为281bp条带,而空质粒可观察到长为1204bp条带。为进一步验证插入序列的准确性，把碱裂解法提取的质粒DNA及过夜摇菌的产物送上海生物工程有限公司测序。 1.2.4转染包装细胞系PhoenixA双嗜性逆转录病毒包装细胞系PhoenixA，培养液为含体积分数0.10胎牛血清、105U/L青霉素、100g/L链霉素的DMEM，于37℃，含体积分数0.05的CO2温箱中培养。当细胞汇合度达80%～90%时，按说明书利用脂质体Lipofectine2000（Invitrogene）将重组质粒pSUPERsiCD59导入PhoenixA细胞，48h后，在倒置荧光显