两亲性可降解聚阳离子核酸载体及层层组装的核酸传递系统.pdf

摘 要 核酸（DNA 、SiRNA）在癌症、心血管疾病、病毒感染等疾病的治疗和预防 上将发挥重要作用，但需要依靠有效的载体运送才能到达靶细胞。病毒载体虽然 能够高效传递基因到靶细胞，但安全性、免疫原性、成本高以及转基因片段小等 缺点限制了其作为基因载体的应用。为了克服病毒载体存在的缺陷，合成类非病 毒载体成为研发的重点。非病毒载体具备可以大规模生产、低免疫原性、易修饰 和可负载大的基因片段等优点，但传递效率仍需提高，因此，本文试图通过合成 的阳离子聚合物及其与核酸组装系统的结构调控来构建高效的核酸递送系统。 本文首先通过开环聚合和原子转移自由基聚合的方法制备了两亲性共聚物 聚己内酯- 接枝 - 聚甲基丙烯酸-N,N- 二甲氨基乙酯阳离子接枝共聚物 (PCL-g-PDMAEMA) 。PCL-g-PDMAEMA 具有较低的临界聚集浓度：8.1×10-4 g/L ， 在水中可组装成表面带有正电荷的纳米粒 (NPs) ，具有同时负载疏水性药物和核 酸的功能。载有紫杉醇的 PCL-g-PDMAEMA NPs 对紫杉醇的释放具有 pH 依赖 性的温度敏感性，在 37 °C、 pH 为 7.4 的缓冲液中释放紫杉醇的速率非常缓慢， 而随着 pH 降低，PCL-g-PDMAEMA NPs 对紫杉醇的释放速率加快。体外转染实 验结果表明，与市售转染试剂 Lipofectamine 2000 相比，在较低 N/P 下，负载 DNA 的PCL-g-PDMAEMA NPs 对 293T 、HepG2 和 PC-3 等多种细胞有较高的转染效 率，且 5%的血清可促进PCL-g-PDMAEMA NPs 在 293T 细胞上的转染效率。激 光共聚焦显微镜研究发现 PCL-g-PDMAEMA NPs/DNA 复合物可以从溶酶体内 逃逸。因此，PCL-g-PDMAEMA NPs 有希望称为一种有效的核酸载体，但不足 的是有一定的细胞毒性。 为了降低PCL-g-PDMAEMA 的毒性，本文继而对该共聚物进行了PEG 修饰。 采用 ROP 和 ATRP 聚合方法合成了两亲性共聚物 mPEG-b-(PCL-g-PDMAEMA) (PECD) 。当N/P 大于4 时，PECD NPs 可以将DNA 完全阻滞，并形成粒径在60-160 nm 、表面带有约 10-18 mv 电荷的复合物。尽管 PECD/DNA 复合纳米粒在较高 N/P 下仍呈现较高的细胞毒性，但PECD NPs/DNA 复合物即使在较低N/P (N/P=5) 下，对 HeLa 、HepG2 等肿瘤细胞以及难于转染的原代神经细胞 DRG 的转染效 率也要高于 Lipofectamine 2000 、PEI 与 DNA 的复合体系。而在 N/P ＝5 时， PECD/DNA 的细胞毒性与Lipofectamine 2000 、PEI 与 DNA 的复合体系相当。激 光共聚焦荧光显微镜研究表明两亲性 PECD/DNA NPs 从溶酶体的逃逸能力明显 强于 PEI ，且稳定性比 PCL-g-PDMAEMA/DNA 强。可见，PEG 的修饰，在一 定程度上改善了 PCL-g-PDMAEMA 基因传递的性能。 为了进一步提高核酸载体体系的性能，本文通过静电层层组装的方法，用 PCL-g-PDMAEMA NPs 、DNA和PGA-g-PEG (聚谷氨酸-接枝-聚乙二醇) 三种物 质制备了三元复合物核酸传递体系，即在PCL-g-PDMAEMA NPs/DNA二元复合 物 表 面 再 组 装 上 一 层 PGA-g-PEG 。 研 究 表 明 ：PGA-g-PEG 的 加 入 对 PCL-g-PDMAEMA NPs/DNA二元复合物的稳定性没有影响，使复合物表面剩余 正电荷大大减少，有效提高了复合物的细胞相容性。体外细胞转染结果证明 PCL-g-PDMAEMA NPs/DNA/PGA-g-PEG三元复合体系的转染效率明显高于二 元复合物，同时死细胞数量大大减少。激光共聚焦显微镜研究表明转染时三元复 合物的稳定性优于二元复合物的稳定性，且细胞对三元复合物的摄取量明显多于 对二元复合物的摄取量。另外，三元复合物从溶酶体内的逃逸能力也要强于二元 复合物的逃逸能力。本文还把叶酸引入到复合物的表面，并通过小