annexinⅡ在人表皮角质形成细胞分化中的表达论文.docVIP

　　annexinⅡ在人表皮角质形成细胞分化中的表达论文 李习玲 连小华 张诚 杨恬 【关键词】 角质形成细胞 【Abstract】 AIM: To explore the expression of annexinⅡ in differentiation of human epidermal keratinocytes. METHODS: ① Normal human epidermal keratinocytes（NHEK） and Ca2+ free keratinocyte groedium (KGM). The proliferation and differentiation of keratinocytes edium and the expression of annexinⅡ munocytochemistry (ICC). ② Immunohistochemistry is. RESULTS: ①），通过改变培养基中的钙离子浓度来调节NHEK的增殖和分化，采用免疫细胞化学(ICC)技术分别检测annexinⅡ在增殖和分化NHEK中的表达. ② 采用免疫组织化学（IHC）技术检测成人及新生儿表皮NHEK中annexinⅡ蛋白的表达. 结果: ①低钙（0.07 mmol/L）培养条件下，annexinⅡ呈弱阳性表达，且主要分布于核周. 高钙（1.5 mmol/L）条件下培养24 h后，annexinⅡ仍呈弱阳性表达,但表达的部位出现明显变化，主要分布于细胞间；48 h后.freelal human epidermal keratinocytes, NHEK）的分化密切相关［5］，为进一步了解其受体annexinⅡ在NHEK分化中的作用，我们一方面通过建立NHEK增殖和分化的体外培养模型，采用免疫细胞化学(ICC)技术分别检测annexinⅡ在增殖和分化NHEK中的表达；另一方面，选用成人及新生儿的皮肤作为研究对象，采用免疫组织化学（IHC）技术检测annexinⅡ蛋白的表达，以探讨annexinⅡ在人表皮NHEK分化中的作用. 1材料和方法 1.1材料细胞培养及组织切片的标本，均来自手术环切的成人及新生儿阴茎包皮. 1.2方法 1.2.1细胞培养将包皮用无菌生理盐水（含青链霉素50×104 u/L）清洗干净后，0.5 mL/L醋酸洗必泰溶液浸泡10 min，去除皮下脂肪，将皮肤剪成0.5 cm×1.0 cm小块，DHanks液（含青链霉素50×104 u/L）清洗3遍，置于2.5 g/L DispaseⅡ（Sigma）中，于4℃消化6 h，分离表皮和真皮，将分离所得的表皮置于2.5 g/L胰酶（Hyclone）中，于室温消化3 min，加入含150 mL/L胎牛血清（Hyclone）的DHanks液终止消化，吹打制备细胞悬液，1000 r离心10 min，弃上清，加入含0.07 mmol/L Ca2+的KGM(CC3158，Cloics)，混匀后按1×109/L接种，于37℃含50 mL/L CO2湿度为950 mL/L的培养箱进行培养. 当细胞长至70%~80%融合时，即可转至含1.5 mmol/L Ca2+的KGM［5,6］. 1.2.2免疫细胞化学（ICC）方法抗K10 mAb(美国Neomarkers公司); 抗annexinⅡ mAb(American Diagnostic公司); SP试剂盒(北京中山公司产品). 具体步骤为：丙酮固定10 min，PBS洗3×3 min. 3 mL/L H2O2甲醇封闭15 min以阻断内源性过氧化物酶，PBS洗3×3 min. 正常羊血清封闭非特异性抗原15 min后，倾去血清，滴加一抗（K10为1∶100稀释，annexinⅡ为1∶500稀释），4℃放置过夜. PBS洗3×3 min，滴加生物素化二抗，37℃放置30 min. PBS洗3×3 min，滴加SP,37℃放置30 min. PBS洗3×3 min，AEC显色，水性封片剂封片，60℃烘烤30 min. K10用DAB显色. 以10 mmol/L PBS替代一抗作为阴性对照，苏木精复染. 1.2.3免疫组化（IHC）方法抗annexinⅡ mAb(American Diagnostic公司); SP试剂盒(北京中山公司). 具体步骤为：皮肤标本在40 g/L多聚甲醛中固定24 h后浸入300 g/L蔗糖脱水24 h，低温恒冷切片机切成6 μm厚切片，风干后丙酮固定10 min，PBS洗3×3 min. 10 mL/L H2O2甲醇封闭15 min以阻断内源性过氧化物酶，PBS洗3×3 min. 正常羊血清封闭非特异性抗原15 min后，倾去血清，滴加1∶500稀释的一抗，