CD59配体肽基因对卵巢癌细胞CD59表达的影响论文.docVIP

　　CD59配体肽基因对卵巢癌细胞CD59表达的影响论文 李伟伟 高美华 张蓓 解西河 【摘要】 目的 研究CD59配体肽基因对卵巢癌细胞CD59表达的影响。方法 构建CD59配体肽基因的真核表达重组体(CD59配体pIRES),转染人卵巢癌细胞A2780,G418筛选稳定表达细胞克隆;RTPCR及TT法测定细胞增殖抑制率。结果 成功构建了CD59配体肽基因真核表达重组体,转染后的A2780 CD59 mRNA及蛋白的表达水平与ethods A eukaryotic expression rebinant of ligandpeptide of CD59 RNA and protein RNA and protein in transfected A2780 cells RNA and protein on the surface of A2780 cells,.freelin;然后94 ℃变性30 s，46 ℃退火1 min，68 ℃延伸2 min，5个循环;最后68 ℃延伸5 min。取上述扩增产物2 μL在30 g/L的琼脂糖凝胶上进行电泳。 CD59配体pIRES真核表达重组体构建及鉴定：spdsDNA片段回收纯化，与Tvector 4 ℃过夜连接，连接产物TSS法转化感受态大肠杆菌DH5α，氨苄青霉素及蓝白斑筛选，随机选取单克隆白斑菌落过夜摇菌，小提质粒。质粒分别行PCR、NheⅠ单酶切、DNA测序法鉴定CD59配体pIRES18T阳性重组子。CD59配体pIRES18T阳性重组子质粒行EcoRⅠ、NheⅠ双酶切，回收纯化外源基因片段。pIRES真核表达质粒的获得与纯化与外源基因片段获得方法相同。外源基因片段与载体的连接、连接产物的转化、阳性重组子质粒PCR及DNA测序鉴定方法同sp18T重组克隆载体。质粒EcoRⅠ、NheⅠ双酶切后，取酶切产物5 μL在15 g/L的琼脂糖凝胶上电泳。 1.2.3 人卵巢癌细胞A2780的转染及稳定转染细胞系的建立 参照《分子克隆实验指南(第3版)》中的方法进行转染,G418压力筛选建立稳定转染细胞系。CD59配体pIRES重组质粒转染细胞命名为CD59配体A2780, pIRES空质粒转染细胞命名为 10 mL (1∶4 000)，37 ℃孵育1 h后洗膜;加入化学发光显色剂ECM显色,暗室条件下X线片感光1 min，显影。用Band Scan分析软件行条带灰度扫描，求其百分比数值后进行统计学分析。 1.2.7 兔抗人A2780细胞抗血清的制备 A2780细胞用含体积分数0.10小牛血清的RPMI 1640培养液培养至细胞生长状态良好。用2.5 g/L的胰酶消化成单细胞悬液，PBS洗3次，调整细胞密度至2×1011/ L，免疫家兔。免疫结束10 d后，心脏采血并自然沉淀分离血清(抗体效价为1∶5 120)。 1.2.8 MTT法检测细胞增殖抑制率 分别收集CD59配体A2780、I 1640基础培养液调整细胞密度至2×108/L，置于96孔培养板中，每孔50 μL。每标本设6个复孔。每孔加兔抗人A2780细胞抗血清及含体积分数0.08新鲜人血清各10 μL, 37 ℃孵育1 h，每孔加浓度为5 g/L的MTT 10 μL,37 ℃孵育4 h，弃上清后加入100 μL DMSO，轻轻吹打混匀后置摇床上50 r/min震荡溶解15 min。于波长630 nm处测各孔吸光度(A)值并计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=1-(实验组A-阴性对照组A)/(阳性对照组A-阴性对照组A)×100%。重复3次取其平均值。 1.2.9 统计学处理 利用SSPS 15.0及PPMS1.55统计软件包进行统计学分析。 2 结 果 2.1 CD59配体pIRES真核表达重组体PCR及酶切鉴定 CD59配体pIRES真核表达重组体进行质粒PCR，电泳后可见长63 bp清晰条带(图1)，CD59配体pIRES真核表达重组体行质粒EcoRⅠ、NheⅠ双酶切，电泳可见长78 bp 清晰条带(图2)，证实CD59配体pIRES真核表达重组体构建成功 2.3 RTPCR检测CD59配体肽基因mRNA表达 CD59配体A2780的PCR产物电泳后可见长约63 bp清晰条带(图3)，证实CD59配体肽真核表达重组体成功转染A2780细胞。 2.4 RTPCR检测CD59 mRNA 的表达 CD59配体A2780及AC中的C8 和(或)C9 结合从而抑制补体的活化。许多研究显示，肿瘤细胞中CD59的表达主要有以下特点。肿瘤细胞可以诱导血管内皮生长因子的分泌, 从而诱导肿瘤细胞表面上调CD59的表达, 增加周围基质中CD59的沉积。在某些肿瘤中一些急性炎症因