转基因体细胞克隆水牛与广西水牛的遗传特性研究.pdf

穿孔能获得更多的转基因抗性细胞集落，转染DNA的纯度和细胞的状态 也明显影晌脂质体法的转染效率。 细胞集落扩大培养，对转染外源基因的抗性细胞系的生物学特性进行了 分析。结果发现，经过G418筛选后细胞增殖活力下降，细胞爬片liE染 色后可看到细胞形态发生变化，凋亡分析发现部分抗性细胞表现出早期 凋亡征状，但染色体核型正常率与正常组相比差异不明显。这些结果表 明，转染本身或随后的筛选过程会对细胞造成一定的损害。 从绵羊基因组扩增得到B-casein基因启动子区到第二内含子区4．1kb 的5’调控序列，从人基因组克隆得到人血小板生成素(TP0)基因长5．5kb 的基因组序列，然后将启动子和TPO定向插入到ploxp骨架上。包含CMV 性化后导入水牛胎儿成纤维细胞中，G418筛选后得到35个抗性细胞集 落，扩大培养后其中4个表达GFP绿色荧光。经PCR鉴定目的基因整合 的完整性，发现1个为完整转EGFP．CN-TPO基因阳性细胞集落。通过 显微操作、电融合的方法将阳性细胞移入体外成熟去核的水牛卵母细胞 内构建重组胚，囊胚率显著低于对照组(P0．05)，说明供体细胞经过 基因转染及长期体外培养筛选对克隆胚胎的早期发育有明显影响；对转 基因体细胞构建核移植重组胚外源基因表达进行检测发现，绿色荧光蛋 白开始表达于4细胞以后的重组胚，说明转染的外源基因能够在胚胎早 期发育过程中表达。 为研究广西沼泽水牛核基因组的多态性，采用23对荧光标记微卫星 引物，对随机抽取的60个广西本地水牛样本进行了PCR检测，然后联 合应用具有多态性的位点进行培养细胞的遗传鉴定。结果发现，23对引 物中，有19对可以获得特异性产物且存在多态，平均有效等位基因数为 态位点。联合应用19个位点对培养细胞的基因组来源进行同一分析，证 明培养细胞与供体水牛基因型完全相同，培养细胞基因组来源于供体水 牛。研究结果表明，18个微卫星标记可进一步用于水牛亲缘关系的分析 研究。 为研究广西沼泽型水牛线粒体D．100p区DNA的多态性，比较分析 沼泽型水牛与河流型水牛之间的差异，本研究对26头广西本地水牛、8 头贵州贵阳水牛、11头广西水牛与河流型水牛杂交后代、9头尼里拉菲 列进行了扩增测序。66头水牛912bp的D．100p多重序列比较结果发现了 147个多态位点，共形成58个单体型，其中中国沼泽型水牛与河流型水 牛后裔单体型明显分成两簇；以牛为外群通过NJ、ML和贝叶斯方法构 建的单体型进化树显示，沼泽型与河流型水牛分成明显两大支，河流型 水牛聚在一起，而在沼泽型水牛内部又分成两个侧支；观察单体型之间 的遗传关系与距离的median network网络分析产生三个区，与进 joming 化树分析结果一致；66头水牛D．100p区序列的碱基错配分布分析表明， 水牛群体在历史上发生两次独立的群体扩增事件。为进一步验证实验结 整合在一起进行分析，在共有序列878bp区域中，包含了158个多态位 点，共获得129个单体型；以牛为外群的进化树分析与单体型网络分析 表明，沼泽型水牛分成两簇，所有的河流型水牛聚集成一紧密的簇，与 进化树结果一致；碱基错配分布分析结果呈现两个明显的峰，进一步推 断水牛群体在历史上发生过两次大的群体扩增。根据上述结果推断：沼 泽型水牛与河流型水牛来自不同的家养化事件，沼泽型水牛起源于中国， 其祖先可能存在两个基因池。 关键词：水牛，转基因克隆，微卫星，线粒体，多态性 STUDIESONTHE TRANSGENICCLONINGAND GENETICANALYSISOFGUANGⅪBURF’ALOS ABSTRACT isolationandinvitrocultureofbuffalofetal Firstly,methofor fibroblasts(BFF) were and contaminationofBFFwere establishd,and karyotypestabilitymycoplasma detected numberof c