分子生物学实验原理学习.ppt

分子生物学实验原理 第一节 分子生物学发展概述 第二节 核酸的提取技术extractive technique of nucleic acid 第三节 核酸分子杂交技术 ⑵ 印迹方法 转移方法不同，可分为 ①斑点或狭缝印迹，即直接将核酸样品点样于固相支持物上； ②虹吸印迹法，利用毛细管虹吸作用，由转移缓冲液带动核酸分子转移到固相支持物上； ③电转印迹法，即利用电场力的作用将核酸带到固相支持物上； ④真空转移法，即利用真空抽滤作用，将核酸分子带到固相支持物上。 根据要转印核酸品种的不同，又可分为 Southern印迹法：是指将电泳分离的DNA从 凝胶中转移到固相支持物上的过程。 Northern印迹法：是指RNA的印迹过程。 步骤： a.DNA分子经限制内切酶酶切。酶切变成合适长度的DNA片段（根据实验目的而定，突变检测则短，定性定量则长）。一般理想的是0.5～10Kb，因片段大小直接影响转移效率。 b.在琼脂糖凝胶中进行电泳。分离DNA片段，经EB（溴化乙锭）染色后观察DNA片段大小，并与DNA分子量标准参照物比较（Marker）。记录或照像各DNA片段位置。尤其留意我们所感兴趣的DNA片段。 （琼脂糖电泳常用于核酸，一般为水平板电泳 SDS电泳常用于蛋白质，一般为垂直板电泳） Southern印迹法 c.将凝胶浸泡于适量的变性液中(1.5mol/L Nacl和0.5mol/L NaOH)室温1h，其目的使DNA变性，即将双链DNA变成单链DNA。如果DNA片段较大(大于15kb)，可在变性前，用稀盐酸（0.2mol/L）处理10min，脱嘌呤后，再进行碱变性处理，使之降解为小片段，因为片段的大小直接影响转移速率。小于15Kb，转移1h，大于15Kb则需要18h。 d.印迹(转移)方法：虹吸印迹法，电转印迹法和真空印迹法。其中常用的是后两种，本教研室常用后一种，真空印迹法。不论采用哪种方法，均是将DNA从凝胶转移到固相支持物上（硝酸纤维素膜、尼龙膜）。 e.固定，上一步骤虽然将DNA转移到固相支持物上，但结合还不牢固，需进一步固定。方法有：对于硝酸纤维膜，可真空下80℃烘烤2h(亦可无真空)，对尼龙膜还可用短波紫外线（波长254nm）照射几分钟进行固定，固定后方可进行下一步的杂交。 Northern印迹法是指将RNA变性及电泳分离后，将其转移到固相支持物上的过程。从而可用于杂交反应以鉴定其中特定mRNA的丰度。 基本原理与Southern印迹相同，但RNA变性方法与DNA不同，不能用碱变性，因为碱导致RNA水解。RNA的变性常与电泳同时进行，常有3种方法，即聚乙醛和二甲基亚砜变性电泳；甲醛变性凝胶电泳和甲基氧化汞电泳，常用的是第二种。 Northern印迹法 RNA经变性电泳后，一般可进行转移（印迹），其印迹方法与Southern方法相同。但对含甲醛的凝胶，可用DEPC预处理水漂洗，以去除甲醛。如果凝胶较浓（大于1％）、较厚（如大于0.5cm）或待测RNA片段较大（大于2.5kb），可预先将凝胶放在0.05mol/L NaOH溶液中浸泡20分钟，以便充分使RNA变性。然后DEPC处理过的水漂洗，最后用20×SSC浸泡45min。 固定方法，常用真空烘烤（80℃）2h。 2．杂交（固－液相杂交）技术 DNA分子杂交实际上是双链DNA的变性和具有 同源序列的两条单链的复性过程。RNA分子杂交也涉 及变性和复性过程（这种变性是单链RNA分子内部发 夹结构打开过程），其基本原理和方法与DNA杂交基 本一致。因此以DNA分子杂交为例进行介绍。 （1）变性 即打开DNA双螺旋结构，变成单链DNA的过程。 变性的方法有：加热变性 有机溶剂变性 高浓度盐变性 碱变性等 常用方法是加热变性和碱变性。 DNA变性时，在260nm处的紫外吸光度增加，这种现象又称 增色效应。当增色效应达到最大值的50%时温度，称熔解温度 （melting temperature Tm值），Tm值表明DNA溶液中一半的 DNA双链已解离为单链，也就是说，Tm值反映了DNA变性的程度 和难易，Tm值越大，变性越难，反之，变性容易。 大多数DNA的Tm值在85～90℃左右。但Tm值并不是一个固