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转基因植物技术 湖南师范大学生命科学学院 袁婺洲 本章目录 5.1 植物的转基因技术 5.2 转基因植物的筛选与检测 5.3 改进转基因的技术 5.4 农作物基因工程 5.4.1 抗虫转基因植物 5.4.2 抗病毒作物 5.4.3 抗细菌和真菌作物 5.4.4 抗除草剂转基因作物 5.4.5 抗非生物胁迫作物 5.5 生物反应器 5.6 转基因植物的安全性 5.6.1 标记基因的安全性 5.6.2 转基因植物安全性评价与争论的问题 第一节 植物的转基因技术 植物细胞培养技术 植物转基因技术的基本路线 转基因的受体系统 外源基因导入植物的方法 一、植物转基因技术的基本路线 1）分离目的基因 2）将目的基因与载体连接，形成重组DNA 3) 利用细菌繁殖扩增重组DNA 4) 将与表达载体相连的重组DNA导入到目标植物的细胞中 5）筛选转化细胞，并诱导产生转基因植株 6）转基因植株大规模种植 二、 转基因的受体系统 1）植物组织受体系统 受伤的组织，愈伤组织等 2）植物细胞原生质体系统 3）生殖细胞受体系统 生殖细胞如花粉细胞、卵细胞为受体细胞。单倍体培养作为受体，或直接在生殖细胞受精时进行基因转化。 4）叶绿体转化系统 叶绿体作为植物受体系统进行基因转化有许多优点：①便于外源基因定位整合，②基因为多拷贝，表达量高，③导入的外源基因性状稳定、安全性好，④能直接表达原核基因。 植物细胞培养技术 植物细胞培养：单个细胞经过培养，通过愈伤组织器官分化或体细胞胚胎分化途径再生出完整的植株的过程。 植物组织培养：不同来源的外植体或不同器官经过培养也可以形成完整的植物的过程。 植物原生质体培养: 除去细胞壁的细胞或被质膜包裹的裸露细胞。 植物花药培养 三、外源基因导入植物的方法 1. DNA直接转移法 1）化学刺激法 PEG、PNA（肽核酸）、磷酸钙、氯化钙等化学试剂等处理原生质体，可使其捕获外源DNA。 2）电击法 在适当的外加电压下，细胞膜可能被击穿，使得外源DNA容易进入细胞内。原生质体不受伤害，而且膜孔可恢复。 3）显微注射法 借助显微注射仪，将外源DNA通过机械方法直接注射到受体细胞。 4）基因枪法 基因枪法，也称微粒轰击法，是将DNA包被到金粒或钨粒中然后把这些粒子加速推进靶细胞。优点是转化受体迅速简单、取材广泛，不受基因型限制，金属微粒的喷射面广，植株可育性高，转化频率高等。 5）脂质体介导法 是将DNA或RNA包裹于脂质体内，然后进行脂质体与细胞膜的融合，通过融合导入细胞。转化效率较高，简单易操作，重复性好。 6）微激光束法 利用激光微束脉冲引起细胞膜可逆穿孔，从而将外源DNA导入受体细胞。 7）花粉通道法 将外源DNA片段在自花授粉后的特定时期注入柱头或花柱，外源DNA沿花粉管通道或传递组织通过珠心进入胚囊，转化不具备细胞壁的受精卵，合子或早期胚体细胞。由于转化的是完整植株的卵细胞、受精卵或早期胚胎细胞，导入的DNA分子整合效率较高。 2.载体介导法 第二节 转基因植物的筛选与检测 报告基因检测 分子生物学检测方法 1.抗生素抗性基因 npt, 新霉素磷酸转移酶基因，对卡那霉素、G418，巴龙霉素及新霉素等具有抗性； aphIV, 潮霉素磷酸转移酶基因，对潮霉素具有抗性； spt, 链霉素磷酸转移酶基因，对链霉素具有抗性； cat, 氯霉素乙酰转移酶基因，使氯霉素丧失抗菌素活性。 aacc3和aacc4, 庆大霉素3－N-乙酰转移酶基因，对庆大霉素有抗性； ble，博来霉素抗性基因，对博来霉素有抗性。 2.抗除草剂抗性基因 bar, 编码膦化麦黄酮乙酰转移酶（PAT），使PPT（膦化麦黄铜）的自由氨基乙酰化而对PPT解毒。抗除草剂草丁膦和双丙氨膦； epsps, 草甘膦抗性标记基因，抗草甘膦； als；绿黄隆抗性标记基因。 3.显色或发光报告基因 GUS酶活性检测 GUS使β－葡萄糖苷酶，能催化裂解一系列的葡萄糖苷，产生一系列具有发色基团或发荧光的物质，可用分光光度计、荧光计或组织化学法对GUS活性进行定量和空间定位分析，检测方法简单灵敏。 荧光素酶活性检测 荧光素酶催化的底物使6－羟基喹啉类似物，在镁离子、ATP及氧的作用下酶使底物脱羧，生成激活态的氧化荧光素，发射光子后，转变成常态的氧化荧光素。 4.分子生物学检测方法 酶联免疫检测（ELISA）：利用抗原与抗体的特异反应，当抗原与抗体结合时，通过结合在抗体上的酶作用于特定的底物后发生显色反应，借助于比色鉴定转基因植物。 PCR技术检测 分子杂交 第三节 改进转基因的技术 转基