氨基酸2013—培训课件.pptVIP

(2). C-末端分析方法 1.羧肽酶法，（Pro不能测） 羧肽酶A：除Pro、Arg、Lys外的所有C端a.a 羧肽酶B：只水解Arg、Lys 2.还原法, 硼氢化锂(LiBH4) 肽-COOH?生成肽-CH2OH?水解,分离,层析鉴定。此法比较少用。 3.肼解法 Val—Ser—Gly 6、多肽链部分裂解成较小的片段 酶解法:胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶等。 化学法：溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。 酶 解 法 A.胰蛋白酶( trypsin ) 专一裂解Lys、Arg的羧基参与形成的肽键。为了减少的作用位点，可用化学修饰将多肽链侧链保护起来，1.2－环己酮封闭Arg，马来酸酐封闭Lys。氮丙啶形成带正电荷点，增加位点。 B.糜蛋白酶(Chymotrypsin) 断裂Phe,Trp,Tyr等疏水AA的羧基所形成的肽键。断裂键邻近的基团，碱性：裂解能力↑，酸性：裂解能力↓ C.胃蛋白酶(Pepsin) 断裂键两侧的殘基都是疏水性或芳香氨基酸残基。其后和前为Pro时抑制。 化学法——溴化氰（BrCN）水解法， 选择性切割甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。 To make trypsin even more versatile you can modify side chains of amino acids Specific Peptide Cleavage Reactions 蛋白质一级结构测定的策略 ① 电泳法：SDS－PAGE ：根据分子量大小分离 ② 离子交换层析法（DEAE—Cellulose、DEAE—Sephadex） 根据肽段的电荷特性分离 ③ 反相HPLC法： 根据肽段的极性分离 ④ 凝胶过滤：根据分子大小 6 、肽段的分离纯化 7、测定各短肽段的氨基酸序列 方法 ：蛋白质序列分析仪 原理： 1. Edman 法 2. DNS- Edman 法 3. 有色- Edman 法 质谱法一般采用高速电子来撞击气态分子，将样品转化为运动的带电气态正离子，加速导入质量分析器，然后按质荷比（m/z）的大小顺序进行收集和记录，测出了离子的准确质量，得到质谱图，根据质谱峰的位置进行定性和结构分析，根据峰的强度进行定量分析 质谱分析法基本原理 Peptide characterization by mass spectrometry 电喷射串联质谱 可分析微量的肽链，短肽在第一台质谱仪中经电喷射电离，按荷质比分离，依次在经碰撞池被裂解成离子碎片，在第二台质谱仪中测出各个离子碎片的谱线，推算出短肽的氨基酸序列。在蛋白质组学中应用广泛，但不能区分亮氨酸和异亮氨酸。 质谱法测序的突出优点是可以识别翻译后修饰 (post-translations modification) 而得到的特殊氨基酸。 思考题： Edman测序和质谱法测序的方法和原理 浙江大学2011生物化学试题 8、重建完整多肽链的一级结构 不同的方法指的是断裂的专一性不同，即切口彼此是错位的。因此两套肽段正好相互跨过切口而重叠，这种跨过切口而重叠的肽称为重叠肽(overlaping peptide)。借助重叠肽可以确定肽段在原多肽链中的正确位置，拼凑出整个多肽链的氨基酸顺序。 9、二硫键位置的确定-对角线电泳来测 点样、滤纸中央 ↓ PH6.5 第一向电流  ↓肽段按大小及电荷分开 ↓ 滤纸暴露在过甲酸蒸汽中（－S－S－断裂） ↓ 含二硫键肽段被氧化成氧化成 一对含半胱氨磺酸的肽  ↓滤纸旋转90 ，PH6.5第二向电流  ↓ 含半胱氨磺酸的成对肽段负电荷偏离对角线  ↓ 茚三酮 AA顺序分析 ↓确定二硫键的位置 二硫键位置的确定-对角线电泳 二硫键位置的确定-对角线电泳来测 2．分离含胡二硫键的肽段可以用 （②） ①　SDS－PAGE电泳；②对角线电泳；③琼脂糖电泳 中科院上海生化与细胞所生物化学2002年 中国计量学院2007 1、为测定蛋白质中的二硫键位置,常采用对角线电泳法, 问点 样时样品应点在下列所指的哪个位置 滤纸的 ①左下角; ②右上角;③边缘中间; ④中央 答( ) 厦门大学生命科学学院2005年考研试题 3、以胰岛素为例，设计一个实验为测定蛋白质中的二硫键位置 浙江大学2011生物化学试题 二硫键位置的确定-对角线电泳来测 4、对角线电泳。先是用专一性适中的蛋白质水解酶，将蛋