肺结核实验室诊断马小玲—培训课件.ppt

* 谢谢！ * * * * * * * * * 2、核酸探针(DNA-probe) DNA探针是一小段带标记而能识别特异性核苷酸序列的单链分子。 3、染色体核酸指纹法： 有多种方法， 如限制性内切酶图谱(REA)和限制性酶切片段长度多态性(RFLP)分析等， RFLP用于菌株菌种鉴定和流行病学调查研究。 * 4、16s～23srDNA(rRNA)序列法 用于分枝杆菌的菌种鉴定，差不多所有种的分枝杆菌都可鉴定出来。 5、耐药基因的检则： 已查出的结核杆菌耐药基因有rpoB(对利福平)，Kat、inhA、ahpC(对异烟肼)，embl(对乙胺丁醇)，rpsL、rrs(对链霉素)，pncA(对吡嗪酰胺)和gyrA(对氟喹诺酮类，gyrB则为低度耐药)等。 * 九、噬菌体生物扩增法（PhaB） 该法1997建立，并用于结核 分枝杆菌耐药性测定。近年来 进展很快。 * 检测原理 　　　 分枝杆菌噬菌体能感染活的分枝杆菌，并在菌体内增殖，裂解菌体，释放出的子代噬菌体，即可感染随后加入的指示细胞（也是一种分枝杆菌），并使指示细胞裂解，在培养皿上出现噬菌斑。 若先将待检菌株与某种药物作用一段时间后在加噬菌体检测，并以不加药管为对照，根据含药管和不含药管出现的噬菌斑情况即可判断细菌的耐药性。 * 噬菌体 －病毒 核酸 衣壳 只能在活的易感細胞內生長 溶原性感染和溶菌性感染 * M.tuberculosis cell 特异性噬菌体识别MTB,并与之结合 * 噬菌体DNA进入MTB细胞,并在其内扩增;同时生产蛋白外壳,开始产生新的病毒颗粒 DNA * 添加特异性杀病毒剂去除所有MTB胞外的噬菌体,胞内噬菌体不受损伤。 * 终止杀病毒反应，添加非致病性，快生长分枝杆菌（敏感细胞） * 结核分枝杆菌破裂，释放噬菌体。 * MTB细胞周围的敏感细胞，并在其胞内增殖 * 经过多个“感染—增殖—细胞消融”循环，在琼脂培养基中的菌苔上形成肉眼可见，清晰的噬菌斑 * * 结核分枝杆菌 杀病毒剂杀灭未感染MTB的噬菌体 敏感细胞 敏感细胞 敏感细胞 敏感细胞 MTB裂解, 释放出来的噬菌体感染敏感细胞 噬菌体感染结核分枝杆菌 产生噬菌斑 先以特异性噬菌体感染、裂解标本中的结核分枝杆菌，再用杀病毒剂清除所有未感染MTB的噬菌体，而结核分枝杆菌胞内的噬菌体继续扩增，进而裂解细胞，释放噬菌体。裂解释放的噬菌体感染随即添加的敏感细胞，在其胞内扩增并裂解敏感细胞，敏感细胞菌苔上肉眼可见的噬菌斑。如待检标本不含结核分枝杆菌，噬菌体被杀病毒剂完全清除，故无噬菌体感染敏感细胞，敏感细胞菌苔上无噬菌斑出现。 * 质控 阳性对照 ≥20个噬菌斑 阴性对照 ≤10个噬菌斑 结果判断标准 标本 阳性结果 ≥20个噬菌斑 阴性结果 ≤19个噬菌斑 阴性： 无噬菌斑 阳性： 可数噬菌斑 阳性： 噬菌斑部分融合 阳性： 噬菌斑完全融合 * 适用范围 可检测痰液、胸水、腹水、脑脊液、尿、骨髓等多种标本 用于结核病的实验诊断 抗痨治疗效果的评价 ※尤其是初诊病人的鉴别诊断※ 用于结核菌耐药性的快速检测 用于HIV高危人群的鉴别诊断 * 药敏试验 * M. tb bacillus Sensor cell Sensor cell Sensor cell Sensor cell Sensor cell 指示细胞 指示细胞 指示细胞 指示细胞 指示细胞 l 室温5分钟 37℃ 1小时 18-24小时 加入杀毒剂 加入培养基和指示细胞 药物＋细菌 ↓ 24-48小时 加入噬菌体 MTB MTB * RFP 敏感株结果 无 RIF 含RIF * RFP耐药株结果 无 RIF 　　含 RIF * 上 海 市 结 核 （肺） 重 点 实 验 室 方法评价－优点 快速：24～48小时 比较灵敏：200～300条/ml 检测活菌： 相对定量： 安全： * 上 海 市 结 核 （肺） 重 点 实 验 室 方法评价－缺点 操作步骤多 影响因素多 有假阳性和假阴性 假阴性率10～88％ 假阳性率2～48％ * 上 海 市 结 核 （肺） 重 点 实 验 室 假阳性和假阴性原因 噬菌体的交叉感染 －6种NT