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鱼类线粒体DNA 阅读文献 鱼类线粒体DNA研究新进展(2004) 鱼类线粒体DNA及其在分子群体遗传研究中的应用（2008） 鱼类线粒体DNA及其研究进展（2011） 鱼类线粒体DNA 的遗传与进化（2000） 鱼类mtDNA及其非编码区的研究现状（2009） 一种改进的鱼类线粒体DNA的快速 制备方法（1997） 两种获取鱼类线粒体DNA的方法比较（2000） 一 鱼类mtDNA的特点 1 分子较小且存在长度多态性 鱼类mtDNA分子大小范围一般在15—20 kb之间，约占总DNA的1％。鱼类mtDNA的分子大小在种间存在差异，但这种长度差异并非源于基因数目，主要由于串联重复序列的存在。 2 编码效率高 同核DNA相比，mtDNA上的基因排列极其紧凑，且无内含子，编码效率较高。此外，部分mtDNA的密码子不同于基因组DNA，且缺少终止密码子，仅以U或UA结尾。 3 拷贝数多 鱼类每个细胞中有1000—10000个线粒体DNA拷贝，容易从组织中分离纯化。 4 进化速度快 鱼类mtDNA的突变率高于核中DNA，为基因组DNA的5一10倍，并且缺乏有效的DNA损伤修复机制，修复效率低。 5 解码体系简单 鱼类mtDNA的解码由一个很小的tRNA体系完成，而不像在核基因组摆动假说中所要求的需要在32个tRNA反密码子上的摆动。 6 遗传的相对独立性 mtDNA能以自身为模板进行复制，能转录生成信使RNA(mRNA)、转运RNA(tNA)和核糖体RNA(rRNA)，也能编码合成一些维持自身结构和功能所必需的蛋白质，具有很大的独立性。同时，线粒体的遗传行为受到核基因的调控，这种调控主要是通过向线粒体输入核DNA编码蛋白质和一些小的RNA，特别是tRNA来实现的 。 7 同质性与异质性 一般情况下，在一种生物机体内仅存在一种类型的mtDNA分子，但现在大量发现一些个体存在多种类型的mtDNA分子，这种特性被称mtDNA分子的异质性。 8 多态性mtDNA中存在多态现象 多态性集中在D环，其他区域则高度保守一。 9 母系遗传 鳗鱼线粒体为双亲遗传 二 鱼类mtDNA的提取方法 （1）直接从鱼类组织提取线粒体DNA 从肌肉、肝脏等组织中提取线粒体DNA 本实验使用常规的碱变性法，将STE液稍加改进作为溶液改进的STE液为：10 mmol NaC1，15 mmol Tris-HC1(pH8.0)，45 mmol EDTA(pH8.0)，0.25 mol蔗糖。把提取的线粒体DNA放人一20℃保存备用。该方法获得的是鱼类的整个mtDNA分子。 选用的组织不同对应用范围的影响 一般肝细胞、胃壁细胞、肾脏细胞中的线粒体数目较多，直接提取mtDNA获得纯度和得率可观的mtDNA用于研究要选取这些组织，必须杀死鱼才能得到，研究存在数量多的鱼类可以采用该法。 （2）先提取基因组DNA再用相应引物PCR 扩增所需mtDNA某一区域序列片段。 从肌肉、肝脏等组织中提取基因组DNA，PCR扩增出mtDNA 区段根据动物基因组DNA提取的一般方法，将DNA提取缓冲液中各个成分含量进行改进，PCR引物为鲤科鱼类线粒体DNA细胞色素b通用引物。 三 鱼类mtDNA研究的方法 1 限制性片段长度多态 mtDNA由于大小、母系遗传方式、易于提纯和进化上的特点等，成为RFLP的最佳靶序列。但mtDNA进化速率较快，不适合于科以上种间的比较研究。目前该法应用较广泛，主要方法有以下几种。 标准RFLP 其研究步骤为：mtDNA样品一RE消化一电泳一结果检测。该法适合于分析样品中靶序列含量相对较高的样品，如mtDNA和PCR扩增产物，还可进行位点比较和片段长度比较。 探针法 又称杂交法。将基因组DNA酶切，用mtDNA探针进行South杂交来识别DNA上的mtDNA谱带，通过自显影检测印迹。 PCR—RFLP法 从细胞总DNA中，用扩增mtDNA某一序列的引物作PCR，RE消化，溴化乙锭染色，电泳检测。这一技术可直接酶切小于500—2 000 bp的短小片段。 2 测序法 直接测定mtDNA的全序列或特定片段的序列。这种方法可获得大量直接可靠的数据，但受技术条件和经费限制，难以适应大群体、大样本的分析。目前，结合PCR技术，可扩增特定基因片段作测序分析，在一定程度上扩展了测序法的应用范围。 mtDNA的研究方法存在局限性 PCR-RFLP法方便、快捷，对样品数量和质量的要求低，费用和时间消耗少，但终究只是对DNA序列的间接反映：而测序法虽可获得大量的较为可靠的数据，但由于技术限制和费用巨大，难以用于大群体和大样本的遗传和进化研究。而且，在