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　　组织工程活性真皮的构建研究论文 胡葵葵，戴育成，袁敬东 【关键词】 成纤维细胞 摘要：目的 探讨用脱细胞真皮(ADM)、胶原海绵膜(SCM)、胶原凝胶构建活性真皮的可行性。方法 从幼儿包皮中纯化、扩增成纤维细胞(Fb)，将其分别种植于ADM、胶原凝胶、SCM上，观察细胞增殖及支架收缩等情况。结果 Fb在ADM上不能成活；在SCM上增殖良好，人工真皮收缩不明显；在胶原凝胶中增殖活跃，但人工真皮收缩明显。结论 利用SCM构建的人工真皮，是一种较理想的活性真皮。 关键词： 胶原；成纤维细胞；支架材料；脱细胞基质 ABSTRACT: Objective To build artificial dermis by using the acellular dermis, collagen membrane and collagen gel as scaffolds. Methods The fibroblasts infant skin. The 3rd generation cells is icroscope or scanning electron microscope. Results The fibroblasts implanted on the ADM began to rupture and died after 2 to 3 days. Though the fibroblasts proliferated is contracted obviously. Another artificial dermis contracted slightly by inoculating fibroblasts on collagen membrane, and the fibroblasts on them is built by collagen membrane as scaffolds has a preferable structure for an ideal substitute of skin. KEY )、脱细胞真皮(acellular dermis matrix, ADM) 、胶原凝胶三种支架，并将成纤维细胞种植于支架上，观察其成活情况，以期为组织工程皮肤的制备奠定基础。 1 材料与方法 1.1 胶原制备 取体重250g左右的SD大鼠1只(江西医学院实验动物部)，消毒后将鼠尾切成1.5cm小段，剔除皮毛，抽出尾腱置平皿中。取1.5g剪碎尾腱浸入0.05mol/L 乙酸(西安化学试剂厂)，置4℃冰箱中，并不时摇动，48h后，移入灭菌离心管中。4000r/min离心30min，吸取上清液，按100mL上清液加5g NaCl的比例加入NaCl晶体，可见多量沉淀析出，再次1000r/min离心10min，弃去上清液，所得沉淀即为胶原。经冷冻干燥后称重，保存于4℃冰箱中备用。 1.2 SCM的制备 将提取的胶原重新溶解于0.05mol/L乙酸中，制成2.5g/L的胶原溶液。将6硫酸软骨素C(Ch6S，美国Sigma公司)溶液滴加于胶原溶液中，搅拌混匀，Ch6S的终质量浓度为80g/L。将上述溶液倒入平底培养皿中，厚约2-3mm；放入-30℃的冰箱内预冻4h以上。将预冻后的胶原快速转入真空干燥机内，真空冷冻干燥36h。待样品温度回升到室温，再逐步加热至105℃，恒温24h即成为SCM。将上述制备的胶原膜浸入0.2%(体积分数)戊二醛(上海化学试剂站)溶液中10min，用过滤自来水漂洗2h，然后换成双蒸水置4℃冰箱24h，去除未结合残存的戊二醛。交联后的胶原海绵，贮存于75%(体积分数)乙醇内备用。 1.3 SCM的检测 采用扫描电镜对支架表面进行扫描，测量其表面孔径大小。将SCM置于10%(体积分数)中性甲醛中固定，经脱水、透明、浸蜡、包埋、切片及脱蜡后，HE染色。并按下面方法进行孔隙率的检测。孔隙率=浸润DHanks的重量(g)-冷冻干燥后的重量(g)/体积(cm3)×100%。共检测10块，取平均值。 1.4 ADM的制备 取刚处死的健康、成年猪背部皮肤，剃毛洗净，用取皮刀取中厚皮片(3-5mm)，无菌操作下修成2cm×2cm大小皮片，置于饱和浓度的NaCl中。过夜，撕去表皮，PBS液冲洗后置于含0.5mmol乙二酸二乙胺(EDTA)＋2.5g/L胰蛋白酶溶液中，4℃，48h ，脱去真皮内的所有细胞成分。此过程中加用叠氮化钠(0.2mg/L),防止细菌污染。然后将制得的皮片室温下置于体积分数为0.05% Triton X100溶液中，持续震摇24h即制得ADM。将上述制备的ADM浸入0.2%(体积分数)戊二醛溶液中10min，无菌PBS液充分冲洗后，保存于4℃ PBS液中备用。 1.5 A