水产微生物实验— 微生物的分离、纯培养与菌种保藏.docVIP

实验四 微生物的分离、纯培养与菌种保藏 一、基础知识 （一）微生物的分离 自然界中各种微生物混杂生活在一起，即使取很少量的样品也是许多微生物共存的群体。人们要研究某种微生物的特性，首先须使该微生物处于纯培养状态，也就是说培养物中所有细胞只是微生物的某一个种或株，它们有着共同的来源，是同一细胞的后代。使用显微操作器单细胞挑取法可以直接得到纯培养。稀释涂布平板法、稀释浇注平板法或平板划线法是分离和纯化微生物的常规方法。后几种方法不需要特殊的仪器设备，一般情况下都能顺利进行，达到好的效果。 微生物的平板分离纯化技术自1880年Koch发明以来已有100多年的历史。该技术的建立和发展为人类获得丰富的微生物资源以及在工、农、医、环境、动植物细胞培养等方面的应用作出了巨大贡献。由此可见，一项新的重大的微生物学实验技术的建立会对整个生命科学带来革命性的变化。 从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用的方法有：平板分离法，该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理包括两方面： (1)选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养、酸碱度，温度和氧等要求或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。 (2)微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获取单个菌落的方法可通过解释涂面平板或平板划线等技术完成。 值得指出的是从微生物群体中经分离生长在乎板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征鉴定方能得到。 （二）微生物的纯培养 不同的微生物在固体、半固体和液体培养基中能表现出各自特有的培养特征，这些特征可以作为不同种类微生物的鉴别特征之一。了解它们的培养特征、掌握其生长规律对识别、控制和利用微生物具有重要价值。 厌氧微生物的分离和培养有其特殊性，主要是采取各种方法使它们处于没有氧的环境或氧化还原电位低的条件下进行培养。随着对厌氧微生物培养方法的改进，发现它们在自然环境中存在的种类和数量都得到大幅度地增加，它们的作用也显得愈来愈重要。 微生物的培养特征是指微生物在固体培养基上、半固体和液体培养基中生长后所表现出的群体形态特征。不同的微生物有其固有的培养特征，这些特征一般用固体。半固体和液体培养基来进行检测。固体培养基又分平板与斜面两种形式。在乎板上主要观察菌落表面结构、形态及边缘等状况；它们培养在斜面培养基上，可以呈丝线状、刺毛状、念珠状、疏展状、树枝状或假根状；生长在液体培养基内，可以呈混浊、絮状、粘液状、形成苗膜，上层清晰而底部显沉淀状；穿刺培养在半固体培养基中，可以沿接种线向四周蔓延或仅沿线生长；也可上层生长很好，甚至连成一片，底部很少生长或底中长得好，上层甚至不生长。 微生物培养特征还包括菌苔的颜色，表面光滑程度、基质是否产生水溶性色素等。培养特征可以作为微生物分类鉴定的指征之一，并能为识别纯培养是否被污染作为参考。 检测微生物的培养特征时，接种和培养过程中必须保证不被其他微生物所污染，因此，除工作环境要求尽可能地避免或减少杂菌污染外，熟练地掌握各种无菌操作接种技术是很重要的。 琼脂平板上的生长表现 细菌在固体培养基表面生长繁殖，可形成肉眼可见的菌落。各种细菌的菌落，按其特征的不同，可以在一定程度上进行鉴别。例如，葡萄球菌在琼脂平皿上，由于产生色素的下同，形成各种颜色的圆形而突起的菌落；炭疽杆菌形成扁平、干燥、边缘不单齐的波纹状菌落，用放大镜观察时，呈卷发样；肠道杆菌属的细菌，形成圆形、湿润、黏稠、扁平、大小不等之菌落；巴氏杆菌和猪丹毒杆菌，形成细小露珠状菌落。菌落的观察方法除肉眼外，可用放大镜，必要时也可用低倍显微镜进行检查。观察的主要内容有： 大小 菌落的大小，规定用毫米(mn)表示，一般不足lmm者为露滴状菌落，1-2mm者为小菌落；2-4mm者为中等大菌落；4-6mm或更大看称为大菌落、巨大菌落。 形状 菌落的外形有圆形、不正形、根足形、葡萄叶形。 边缘 菌落边缘有整齐、锯齿状、网状、树叶状、虫蚀状、放射状等。 表面性状 观察其表面平滑、粗糙、皱襞状、旋涡状、荷包蛋状，甚至有子菌落等。 隆起度 表面有隆起、轻度隆起、中央隆起，也有陷凹或堤状者。 颜色及透明度 菌落有五色、灰白色，有的能产生各种色素；菌落是否光泽、透明、半透明及不透明。 硬度 黏液状、膜状、干燥或湿润等。 溶血 若是鲜血琼脂平皿，应看其是否溶血，溶血情况怎样。 （2）琼脂斜面上生长表现 将各种细菌分