水产微生物实验—微生物大小及数量测定.docVIP

实验八 微生物大小及数量测定 一、基础知识 （一）微生物大小测定 微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微生物大小的测定，需要在显微镜下，借助于特殊的测量工具——测微尺，包括目镜测微尺和镜台测微尺。 镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般是将lmm等分为100格，每格长0．01mml(即10m)。镜台测微尺并不直接用来测量细胞的大小，而是用于校正目镜测微尺每格的相对长度。 目镜测微尺是一块可放入接目镜内的圆形小玻片，其中央有精确的等分刻度，有等分为50小格和100小格两种。测量时，需将其放在接目镜中的隔板上，用以测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同，目镜测微尺每小格所代表的实际长度也不一样。因此，用目镜测微尺测量微生物大小时，必须先用镜台测微尺进行校正，以求出该显微镜在一定放大倍数的目镜和物镜下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。然后根据微生物细胞相当于目镜测微尺的格数，即可计算出细胞的实际大小。 球菌用直径来表示其大小，杆菌则用宽和长的范围来表示。如金黄色葡萄球菌直径约为0．8μm。枯草芽孢杆菌大小为0.7-0.8×2-3μm。 （二）微生物数量的测定 单细胞微生物个体生长时间较短，很快进入分裂繁殖阶段，因此，个体生长难以测定，除非特殊目的，否则单个微生物细胞生长测定实际意义不大。微生物的生长与繁殖(个体数目增加)是交替进行的，它们的生长一般不是依据细胞的大小，而是以繁殖，即群体的生长作为微生物生长的指标。 群体生长表现为细胞数目的增加或细胞物质的增加。测定细胞数目的方法有显微镜直接计数法、平板菌落计数法、光电比浊法、最大近似值法(MPN)，以及膜过滤法等，测定细胞物质的方法有细胞干重的测定，细胞某种成分如氮的含量、RNA和DNA的含量测定，代谢产物的测定等。总之，测定微生物生长量的方法很多，各有优缺点，工作中应根据具体情况要求加以选择。 本实验主要介绍生产、科研工作中比较常用的显微镜直接计数法和平板菌落计数法。 1．显微镜直接计数法 显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上(又称计菌器)，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。目前国内外常用的计菌器有：血细胞计数板、Peteroff-Hauser计菌器以及Hawksley计菌器等，它们都可用于酵母、细菌、霉菌孢子等悬液的计数，基本原理相同。后两种计菌器由于盖上盖玻片后，总容积为0.02mm3，而且盖玻片和载波片之间的距离只有0.2mm，因此可用油浸物镜对细菌等较小的细胞进行观察和计数。除了用这些计菌器外，还有在显微镜下直接观察涂片面积与视野面积之比的估算法，此法一般用于牛乳的细菌学检查。显微镜直接计数法的优点是直观、快速、操作简单。但此法的缺点是所测得的结果通常是死菌体和活菌体的总和。目前已有一些方法可以克服这一缺点，如结合活菌染色，微室培养(短时间)以及加细胞分裂抑制剂等方法来达到只计数活菌体的目的，本实验以血球计数板为例进行显微镜直接计数，另外两种计菌器的使用方法可参看各厂商的说明书。 用血细胞计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。该计数板是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为九个大，方格，中间的大方格即为计数室，血细胞计数板构造如下图。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成25个中方格而每个中方格又分成16个小方格；另一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格，但无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是400个。每一个大方格边长为1mm，则每一个大方格的面积为1mm ，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0．1mm，所以计数室的容积为0．1mm，(万分之一毫升)。 计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上25或得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成1ml菌液中的总菌数设五个中方格中的总菌数为A，菌液稀释倍数为B，如果是25个中方格的计数板，则： 1ml的菌液中的总菌数=（A/5）×25×10×1000×B 2．平板菌落计数法 平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到乎扳经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应优表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的2-3或更多个细胞。