发酵课程论文-基因工程菌高密度发酵研究进展.docVIP

发酵工程 课 程 论 文 基因工程菌高密度发酵研究进展 院 系 生命科学学院 班 级 学 号 姓 名 任课老师 成 绩 2013年6月 基因工程菌高密度发酵研究进展 东北农业大学 黑龙江 哈尔滨 150030 摘要：通过高密度发酵可以提高细胞生长密度、目的蛋白的表达含量。本文就基因工程菌高密度发酵工艺的几个主要影响因素，包括重组菌构建、培养条件、生长抑制因子以及它们的控制技术进行综述。分析了这些因素对目的蛋白表达的影响；介绍了基因工程菌高密度发酵领域的一些研究进展。 关键词：基因工程菌；高密度发酵 高密度发酵工艺（HCDC）又称高密度发酵技术，是在传统发酵技术上改进的发酵技术，它采用增加工程菌对数期的生长时间、相对缩短衰亡时间来提高菌体的发酵密度，极大地改进了发酵工艺，最终提高产物的比生产率（单位体积单位时间内产物的产量），不仅可减少培养体积，强化下游分离提取，还可以缩短生产周期，减少设备投资从而降低生产成本，极大地提高了在市场上的竞争力。大肠杆菌高密度培养工艺广泛地应用于重组蛋白的生产，这主要是由于大肠杆菌的遗传学和生理学已基本被认清[1]。产量的高低主要取决于细胞密度、目的蛋白的表达含量。但在培养过程也存在一些问题，如氧、基质的利用率、小分子物质、生长抑制物的积累等。因此，减少抑制物的形成,提供良好的生长条件是必要的。 1　重组大肠杆菌构建的影响因素 宿主菌的选择 宿主菌的稳定性会影响外源基因的表达，不同的大肠杆菌菌株在培养条件和外源基因表达能力上存在很大差别。目前普遍应用的大肠杆菌BL21(DE3) plysS因其带有编码T7溶菌酶的小质粒，而有效地降低杂蛋白的表达，且不影响IPTG诱导目的蛋白的表达水平，从而成为近年来最为常用的宿主菌[2]。Walle等引用两种常用商业宿主菌E.coli BL21(DE3)和JM109 进行了乙酸代谢研究，发现前者的乙酸积累仅是后者的1/4，发酵密度也提高25%。因此，不同宿主菌的选对表达产物的积累以及下游分离纯化都有至关重要的作用。 1. 2　质粒载体 　　重组大肠杆菌中构建的质粒载体对外源基因的表达也产生了很大影响。常用的基因表达载体有pET、pSC、pPBB、pUC系列以及由它们衍生的一系列优化载体。 质粒载体的拷贝数和稳定性不仅受宿主菌生理状况及生长环境的影响，而且还取决于自身的遗传特性。质粒载体的拷贝数并不是越高越好，因为有些克隆的编码基因，当用高拷贝数质粒作载体时，其产物含量过高会严重地扰乱寄主细胞正常的新陈代谢活动。质粒不稳定性通常有以下两种情况： (1) 分离不稳定性；(2) 结构不稳定性。另外环境条件也会影响质粒的拷贝数，如葡萄糖、NH4+等因子的限量供应以及pH变化都会引起质粒拷贝数的下降。已有报道通过正交实验考察了E.coli HB101 (pBR322) 高密度培养过程中，不同培养条件对质粒稳定性影响，结果表明当温度在33～39℃、pH为6.4～7.2、DO为40%～80%时质粒没有丢失现象[3]。 培养条件 2. 1　营养源 高密度发酵的生物量达150~200 g/L，为满足细菌快速生长及大量表达基因产物的需要，常需投入2～5倍于生物量的基质，加上利用率，实际量远高于此值。大肠杆菌高密度发酵使用的培养基多为半合成培养基，其各组分的浓度和比例对发酵影响很大。如碳源和氮源比例偏小，会导致菌体生长旺盛，造成菌体提前衰老自溶；而其比例偏大，则菌体繁殖数量少，细菌代谢不平衡，不利于产物积累。由于优化碳源是大肠杆菌发酵的关键因素，人们就碳源对高密度发酵的影响做了大量研究。葡萄糖是目前最常用的碳源物质。通过对重组大肠杆菌生产谷胱甘肽(GSH)发酵条件的研究表明：初糖浓度为10 g/L时, 重组大肠杆菌WSH2KE发酵24 h，细胞干重达最大，细胞内GSH含量也高于其它糖浓度[4]。对高密度发酵大肠杆菌生产重组人骨形成蛋白22A的研究也表明：基质中初糖浓度为10 g/L时细胞浓度和产物表达量均获得了较好效果[5]。上述研究表明：当培养基中糖初始浓度为10 g/L时，可获得理想的发酵效果。如果培养基中糖浓度过高，超过菌体生长需要量，则会导致乙酸生成。糖浓度超过50 g/L时大肠杆菌的生长将受到抑制[6]。以甘油代替葡萄糖作为碳源则可减少代谢副产物——乙酸的积累，而且更易达到重组菌的高密度和外源蛋白的表达[7]。 除碳源外，培养基中的氮源、微量元素和各种无机盐含量对大肠杆菌发酵也有较大影响。一般而言，大肠杆菌培养时营养的抑制浓度为：葡萄糖(50 g/L)、氮(3 g/L)、Fe2+(1