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　　靶向COX论文 谯敏，向廷秀，王丕龙，黄爱龙 【关键词】 RNA干扰；环氧化酶 【Abstract】AIM: To investigate the inhibitory effect of siRNA targeting COX2 on the groa cells of oderate or poor differentiation (MKN28, SGC7901, BGC823) and related mechanism. METHODS: siRNA targeting COX2 gene a cells to induce RNA interference. The changes of COX2 icroscopy, and expressions of Bax and Bcl2 ost no changes in control group in vitro. CONCLUSION: RNA interference inhibits the groa cells, ay be related to doa cells. 【Keyach neoplasms 【摘要】目的： 利用RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术在体外抑制COX2表达，研究其抑制三种不同分化程度的胃癌细胞（MKN28，SGC7901，BGC823）的可能性，探讨RNAi抑制胃癌生长与胃癌细胞分化程度的相关性. 方法： 设计靶向COX2基因的siRNA.freelall interfering RNA, siRNA), 作用于三种分化程度不同的胃癌细胞株，研究COX2基因特异的siRNA对胃癌细胞生长的抑制、可能的作用机制以及与胃癌细胞株分化程度的相关性，为COX2抑制剂应用于胃癌治疗提供理论基础. 1材料和方法 1.1材料中分化胃癌细胞株SGC7901和低分化胃癌细胞株BGC823细胞株由重庆医科大学病理生理学教研室提供；高分化胃癌细胞株MKN28细胞株购自上海消化疾病研究所；质粒pTZU6+1由重庆医科大学感染性疾病重点实验室黄爱龙教授惠赠；限制性内切酶XbaI, SalI, HindIII和EcoRI以及连接试剂盒购自美国TakaRa公司；质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自美国Promega公司；总RNA提取试剂、RTPCR试剂盒购自美国Qiagen公司；转染试剂lipofectamine 2000购自Invitrogen公司；COX2，Bax和Bcl2多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；COX2引物和内参GAPDH引物以及siRNA转录模板由北京三博远志生物工程技术有限服务公司和大连宝生物公司合成. 1.2方法 1.2.1siRNA结构的设计和合成根据siRNA设计原则［3］和COX2编码序列，设计19nt的DNA片段，中间为4个碱基的与目的基因无同源性的插入序列(TTCG)，末端终止子为TTTTT，并利用BLAST进行查询，确定其为特异性序列. 合成的DNA两端设计有XhoI或XbaI酶切位点，便于与pTZU6＋1载体连接. 设计合成pTZU6+1siRNACOX2转录模板序列（正义：5′ GCCTT CTCTAACCTCTCCT3′，反义：5′AGGAGA GGTTAGAGAAGGC 3′）；相应合成的干扰序列（正义：5′TCGAGGCCTTCTCTAACCTCTCCTTTCGAGGAGAGGTTAGAGAAGGCT TT TT3′）（反义：5′CTGAGAAAAAAGCCTTCTCTAACCTCTCCTCGAAA GGAGAGGTTAGA GAAGGCC3′）. 1.2.2重组载体siRNA的构建内切酶SalI和XbaI酶切转录载体pTZU6+1，然后与纯化的双链DNA片段在T4 DNA连接酶作用下，4℃连接过夜，转化大肠肝菌JM109，Amp抗性筛选. 筛选克隆提取DNA，用EcoRI和HindIII双酶切，并用相同的酶酶切载体pTZU6+1作为对照，琼脂糖凝胶电泳并测序鉴定. 构建的重组质粒命名为pTZU6+1siRNACOX2（简称siRNACOX2）. 1.2.3质粒转染细胞在含100 mL/L小牛血清的RPMI1640培养液, 37℃, 50 mL/L CO2孵箱中培养. 转染时，将细胞消化、离心并重悬后稀释为1×109个/L，以2 mL/孔接种于6孔培养板中，置37℃培养过夜. 于次日用siRNACOX2分别转染三种细胞，同时设pTZU6+1空载体转染的阴性对照和只接种细胞，不作处理的空白对照. 在无血清、无抗生素的RPMI1640培养液培养4~6 h后换新鲜的含100 mL/L小牛血清的RPMI1640培养液，继续培养2~4 d 后检测各指标. 1.2.4RT P