靶向HPV18 E6基因不同锌指结构编码序列的siRNA对宫颈癌HeLa细胞作用的比较论文.docVIP

　　靶向HPV18 E6基因不同锌指结构编码序列的siRNA对宫颈癌HeLa细胞作用的比较论文 殷广洁 罗兵 王言奎 【摘要】 目的 探讨靶向HPV18 E6基因不同锌指区编码序列的siRNA对HeLa细胞的影响。方法 分别设计靶向E6蛋白不同锌指区编码序列的两对siRNA，脂质体法转染HeLa细胞。半定量RTPCR检测E6 mRNA转录表达水平；四甲基偶氮唑盐比色法（MTT法）检测细胞增殖活性；流式细胞仪Annexin VFITC/PI双染检测细胞凋亡情况。结果 与siRNASCR转染组比较，RTPCR结果显示，siRNA1和siRNA2转染后E6表达水平明显降低（F=8.709，P 0.05）， 且siRNA2组较siRNA1组下降更为显著（t=3.61，P 0.05）。MTT结果提示，2对siRNA转染后48 h和72 h的细胞增殖活性均明显下降（F=60.583、102.421.freelically synthetic siRNA targeting to HPV18 E6 ine 2000, then the mRNA levels of HPV18 E6 etry used to detect proliferation and cell apoptosis,respectively. Results pared ore obvious in siRNA2 group (t=3.61,P 0.05). MTT results at 48 h and 72 h shoore apparente effect (t=4.717,7.932;P 0.01). Floetry revealed no significant apoptosis. Conclusion The siRNA targeting to the zinc finger Ⅱ more effectively inhibit the expression of E6 and the proliferation of HeLa cells. Maybe zinc finger Ⅱ is the key structure leading to the malignant transformation and outofcontrol proliferation of HeLa cells. ［KEY EM（购于GIBCO公司）培养液中，置于37 ℃，体积分数0.05的CO2饱和湿度的培养箱内培养。 1.1.2 试剂 LipofectamineTM 2000及TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司；AMV逆转录试剂盒购自美国Promega公司；细胞凋亡检测试剂盒购自美国BECKMAN COULTERTM 公司。 1.2 siRNA设计合成 靶向HPV18 E6 ZF1和ZF2编码序列的2对siRNA，即siRNA1和siRNA2由广州锐博制药技术有限公司合成并行HPLC纯化。其中siRNA 1序列为：正义链(5′～3′)GACAGUAUUGGAACUUACA，反义链(3′～5′)CUGUCAUAACCUUGAAUGU，靶位点为HPV18 E6 108～126位碱基；siRNA 2序列为：正义链（5′～3′）ACGACGAUUUCACAACAUA，反义链（3′～5′）UGCUGCUAAAGUGUUGUAU，靶位点为HPV18 E6 372～390位碱基。同时设计合成阴性对照siRNASCR (错译siRNA，scramble siRNA)，序列为：正义链（5′～3′）GUACGCCAAAAGUUAAACC，反义链(3′～5′)CAUGCGGUUUUCAAUUUGG。该3对siRNA经BLAST同源性检索确认均与人类基因无明显同源性。 1.3 siRNA转染 根据LipofectamineTM 2000试剂操作指南，采用通用型荧光标记的阴性对照siRNA进行转染条件的优化。取对数生长期的HeLa细胞，调整细胞密度，接种于细胞培养板，用含体积分数0.10血清不含抗生素的DMEM培养，当细胞生长至60%～80%汇合时弃去旧的培养液，按照LipofectamineTM2000说明书进行转染。转染12 h后于荧光显微镜下观察转染效率，确定siRNA与LipofectamineTM2000最佳转染比例，然后按照此比例行实验组和对照组siRNA转染。 1.4 半定量RTPCR检测E6 mRNA表达水平 收集转染后48 h时的细胞，采用TRIzol一步法提取HeLa细胞总RNA，参照逆转录试剂盒要求的标准条件合成cDNA用作PCR反应模板。PCR反应体系容量为25 μL，包括10×buf