靶向Livin的siRNA提高MDAMB231细胞对阿霉素敏感性的可能机制论文.docVIP

　　靶向Livin的siRNA提高MDAMB231细胞对阿霉素敏感性的可能机制论文 李凡 王小毅 田甜 陈力 李佳 任国胜 【摘要】 目的： 采用RNA干扰技术下调Livin基因的表达，观察其提高乳腺癌细胞对阿霉素化疗的敏感性及机制. 方法： 构建3个靶向Livin的siRNA真核表达载体，转染乳腺癌细胞MDAMB231后，通过实时定量PCR，TT法检测细胞增殖的变化以及细胞对阿霉素的半数抑制浓度（IC50），流式细胞法检测细胞周期，TUNEL法检测其诱导细胞对阿霉素化疗增敏作用，并观察细胞超微结构变化. 结果： 成功构建了针对Livin基因的3个特异性siRNA表达载体.freelRNA和蛋白抑制效率最高，分别为76.4%和70.2%，同时Caspase3的mRNA和蛋白表达升高约157.1%和38.6%（P 0.05）. siLivin2转染48 h后，与未转染组相比，细胞增殖活力受到抑制，siLivin2联合阿霉素使细胞周期阻滞于G0/G1期（P 0.05），显著提高了细胞对阿霉素敏感性，其凋亡率达到(38.35±2.64)%，IC50降低为（2.46±0.87） mg/L，差异具有统计学意义（P 0.05）. 透射电镜下可见细胞胞质浓缩，染色质聚集为小团块，电子密度增高. 结论： 靶向Livin siRNA真核表达载体可以有效地下调MDAMB231细胞Livin基因的表达，并且通过上调Caspase3的表达抑制细胞增殖，显著增强其对阿霉素的敏感性. 【关键词】 乳腺肿瘤；Livin基因；RNA干扰；阿霉素 0引言 Livin基因是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族的新成员，它在肿瘤组织中特异性表达并具有强大的抗凋亡作用，已成为肿瘤基因治疗新的靶点［1］. 近年的研究［2］认为，凋亡是化疗药物诱导肿瘤细胞死亡的主要模式，IAP家族在调节肿瘤细胞对凋亡敏感性方面起着核心作用. 而特异性阻断肿瘤细胞内高表达的Livin基因，可以抑制细胞增殖并增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性［3］，但其化疗增敏作用的发生机制尚不明确. 我们通过构建靶向Livin的siRNA真核表达载体，转染乳腺癌细胞MDAMB231，观察Livin表达下调对细胞阿霉素化疗敏感性的影响，并探讨其发生的可能机制. 1材料和方法 1.1材料人乳腺癌细胞株MDAMB231（中科院上海细胞资源中心）；shRNA质粒载体pGeneSil1（武汉晶赛公司）；LipofectamineTM2000（美国Invitrogen公司）；质粒提取试剂盒（美国Omega公司）；总RNA提取试剂、实时定量PCR扩增试剂（大连TaKaRa公司）；兔抗人多克隆抗体Livin（美国Imgenex公司）；兔抗人多克隆抗体Caspase3，辣根过氧化物酶标记羊抗兔多克隆抗体（北京中杉生物技术有限公司）；TUNEL检测试剂盒（德国Roche公司）. 1.2方法 1.2.1靶向Livin的siRNA真核表达载体的构建利用Ambion公司在线设计程序，针对GenBank中Livin（No.NM022161，No.NM139317）的共同序列，筛选出三条干扰序列，即siRNA1：5′CTGGCCTCCTTCTATGACT3′；siRNA2：5′GGAAGAGACTTTGTCCACA3′；siRNA3：5′CCGTGTCCATCGTCTTTGT3′；同时设计非特异性靶序列：5′GACTTCATAAGGCGCATGC3′. 将化学合成的正义链和反义链退火，与经HindⅢ和BamHⅠ酶切后线性化的pGeneSil1载体连接，经筛选，酶切鉴定后测序. 所得质粒命名为siLivin1, siLivin2, siLivin3和 siHK. 1.2.2MDAMB231细胞的培养和转染MDAMB231细胞用含100 mL/L胎牛血清、1×105 U/L青霉素和1×105 U/L链霉素的RPMI1640培养液，于37℃，50 mL/L CO2的恒温箱中培养传代. 转染前将细胞接种于6孔板,待细胞生长至密度为70%～90%时，按照LipofectamineTM2000说明书转染重组质粒. 1.2.3实时定量PCR检测细胞接种于6孔板，分为未转染组，siHK组，脂质体组，siLivin1组，si Livin2组和siLivin3组. 转染48 h后收集细胞，按照试剂说明书提取细胞总RNA. 以cDNA为模板，进行实时定量PCR反应. PCR扩增条件：95℃ 10 s,1个循环；95℃ 5 s，60℃ 31 s，40个循环；95℃ 15 s,60℃ 60 s,95℃ 15 s,1