DNA酶切(ye).pptVIP

DNA的酶切 一.实验目的 二.实验原理 三.实验用具及材料 四.实验方法及步骤 五.注意事项 一.实验目的 了解DNA限制性内切酶的作用原理； 学习和掌握利用限制性内切酶进行DNA消化的方法和技术。 二.实验原理  限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。 利用限制性内切酶切割DNA是DNA重组过程中的关键步骤之一。成功的酶切为后续工作提供了有效的实验材料 。 根据限制性内切酶的特性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三种类型。本实验使用其中的Ⅱ型酶对DNA分子进行切割，并得到粘性末端或平末端。 限制性核酸内切酶的特性 EcoR I 5‘……G A A T T C…..3 →5‘……G AATTC……3 3……C T T A A G……5 →3……CTTAA G……5‘ SmaⅠ 5‘……C C C G G G……3 → 5‘……C C C G G G……3 3’……G G G C C C……5’ → 3’……G G G C C C ……5’ 1.各种限制性内切酶能专一的识别碱基序列，如EcoR I， SmaⅠ可以识别6个碱基的序列： 2.识别碱基对数目一般为4-6bp长度范围。 3.识别序列大多为二重对称，有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ);有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端, 如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。 当限制性内切酶作用于DNA时可以形成的酶切片段数为： 片段数目 =?切点数 +1?? （线状DNA） 片段数目 =?切点数?????? （环状DNA） 4.有些来源不同的限制性内切酶可以切割相同的序列，这些酶称为同裂酶。有些限制性内切酶识别位点不同，但对DNA切割后产生相同匹配的粘性末端。 5. 在酶切反应中，DNA的纯度、缓冲液中的离子强度、Mg2+等因素均可影响反应，一般可通过增加酶的用量，延长反应时间等措施以达到完全酶切。 6. 限制性内切酶的活性以酶的活性单位表示，1个酶单位（1Unit）指的是在指定缓冲液中，37℃下反应60min,完全酶切1μg的纯DNA所用的酶量。但在酶切反应中，由于DNA纯度及缓冲液条件等影响，所以酶的单位常过量一点。 三.实验用具及材料 1.器材 恒温水浴锅，电泳仪，水平电泳槽，微量移液枪 2、试剂 （1）EcoR I限制性内切酶； （2）HindⅢ酶切标准DNA分子量的DNA样品； （3）纯化的pBR322质粒DNA; (4)纯化的pXZ6质粒DNA; (5)10X酶切缓冲液； （6） 无菌水； （7）电泳所需试剂 四.实验方法及步骤 pMD19-T质粒（T载体）双酶切 取质粒样品于0.5ml离心管中， 按右表加入试剂： ?? ↓ 混匀；4000rpm离心30s,甩至管底 ↓ 37℃,保温2h酶切 ↓电泳 用紫外投射仪检测 ↓ 65℃，保温15’使酶失活,停止反应 ↓ 与纯化的表达载体PET-28A（经相同酶切反应）进行连接，来研究OVO该基因的相关功能 五.注意事项 1.注意吸样的准确性； 2、加样的次序：依次为水、缓冲液、DNA,最后为酶，不应颠倒。加酶步骤要在冰浴中进行，在加酶前应先将水、缓冲液及待切DNA混匀； 3、注意取塑料器皿时，用镊子夹取，防止手上杂酶的污染； 4，当样品在37 ℃ 与65℃保温时，注意：a,防止水蒸气进入；b,防止标签脱落，分不清样品类型 5.37℃保温一段时间后可取少量样品电泳检测，电泳前先离心2S，避免酶切体系减少。若已达到酶切目的可结束反应。 6. 用两种酶酶解同种DNA时要注意酶解缓冲液是否一致。如果一致可在同一体系内加两种酶或各切一半DNA。电泳检查切开后，再合并体系，继续酶解1h；如果酶切缓冲液不同，原则上先切低浓度缓冲液的酶，电泳检查切好后，再补加高浓度盐与酶继续酶切相应时间。 4，为了控制反应体积和促进反应进行，要求模板DNA的浓度应很高，否则反应体系中DNA浓度太低则将引起酶反应动力学改变、降低酶解效果，此时不得不增加反应体积；而一般为了增加DNA储藏的稳定性，DNA多保存在TE缓冲液中，如反应体系中过多加入模板DNA溶液则势必造成反应体系中EDTA浓度升高，而对酶产生抑制。因此如底物DNA浓度过低则应进行浓缩。 * * 酶切反应成分（单位：μl） ?ddH2O 12 DNA样品