DNAguided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute1.pptVIP

DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute 摘要 RNA导向的核酸内切酶Cas9使得基因编辑成为了一种广泛应用的技术。类似于Cas9,来自Argonaute蛋白家族的内切酶也可以利用寡核苷酸作为引导，降解侵入性的基因组，这项研究报道称NgAgo是一种DNA导向的可用于人类细胞基因编辑的核酸内切酶。 NgAgo可结合约24个核苷酸大小的5’磷酸化单链导向DNA（guide DNA，gDNA），有效形成位点特异的DNA双链缺口。与Cas9不同的是，NgAgo-gDNA系统不需要前间区序列邻近基序(protospacer adjacent motif，PAM)序列，初步鉴定表明，该系统对导向-靶向错配耐受低，而且对编辑富含G+C的基因组更加有效。 讨论 Ardonautes作为RNA诱导沉默复合体（RISC)的主要成员被广泛研究，其可以介导RNA干扰。我们所报道的Ardonaute是从N. gregoryi SP2分离出来的，它是一种DNA导向DNA的核酸内切酶，它可以在哺乳动物细胞内切割基因组DNA。NgAgo利用DNA-DNA杂交来切割目标位点，而且与Cas9类似，能通过单一蛋白切割基因组序列，但是，作为基因编辑的一个工具， NgAgo比Cas9具有潜在的优点。 NgAgo导向ssDNA仅是一个5’磷酸化的大小约24nt的片段。在本研究中，我们针对10个基因测试了50多个靶序列，发现对其他导向序列无偏好，并且在哺乳动物和细菌中同样适用。NgAgo序列是Cas序列长度的2/3（887aaVS1368aa）。相比之下，Cas9与DNA结合时，它的sgRNA需要含有3’tracrRNA延伸的3个发卡结构和一个PAM序列。对于NgAgo当gDNA缺乏一个特定的共识序列时，不能增加脱靶活性，这与其他报道一致。我们发现在哺乳动物中胞内5’磷酸化的ssDNA的数量非常有限，然而，测定其是偏好导向序列还是靶向序列还需要进一步的高通量分析。NgAgo的一个值得注意的特性是它不仅能切割双链DNA，还可以从目标序列中敲出几个核苷酸，这个特点似乎在进化史上有优势，就是使入侵基因组更难修复。 NgAgo基因编辑的有用特征包括以下四点： 首先，对导向-靶向的错配容忍力低，在我们的实验中，在gDNA中任意一个位点出现单核苷酸错配时， NgAgo的切割效率会降低，而且当有三个碱基错配时， NgAgo的作用完全消失。 其次，在哺乳动物中5’磷酸化的短ssDNA很稀有，这可以最大限度地减少细胞内的寡核苷酸误导NgAgo的可能性。 第三， NgAgo很专一，一旦和一条导向DNA结合之后，“专一”的NgAgo就不会在37℃条件下将它“抛弃”。所有这些特点都能最大限度地减少脱靶率。 最后，设计和合成ssDNA及调整它们的浓度很容易，而对于Cas9-sgRNA系统很难 * MedSci指数（MI），它代表中国人投稿杂志的偏向。指数高，表明国内投向该杂志的文章多，或这个杂志比较容易投中。另外，它还提供文章其它投稿信息的指导。供在选择杂志时参考使用。MedSci指数不是通常的影响因子IF，MedSci指数是指国人投稿的热度，即投稿的偏好，因此该指数越多竞争对手的就越多。IF则是杂志被别的论文引用的频度，与中国科研者的投稿热度关系不大。 Figure 2 NgAgo binds ssDNA guide in a one-guide-faithful manner. (a) Electrophoresis of nucleic acids bound to NgAgo that had been expressed in 293T cells and extracted after 48 h growth with or without the indicated 24-nt nucleic acids. M1, ssDNA ladder; M2, ssDNA guide. (b) Electrophoresis of nucleic acids bound to NgAgo that had been expressed in 293T cells with transfection of a 5′ phosphorylated ssDNA guide (FW) with delays as indicated, and extracted 48 h after initial transfection of NgAgo-encoding