酶切若干问题指南.docVIP

酶切现象及影响因素详解 (1) 质粒 要是对质粒进行酶切，那么质粒的纯度挺重要，污染有DNase 和残留质粒提取中的酚以及高盐对DNA酶切都不利，还有RNA要去除干净。以上所提的这些这都会影响酶切效果。 解决方法 DNase污染 ：质粒提取的试剂都要进行灭菌，提取时不要拖拉，电泳缓冲液要长换，以免电泳液造成DNA降解，电泳液的pH不要偏酸，容易降解DNA.在最后溶解DNA时，可以采用TE和水，建议用TE，TE可以鳌合金属离子，使DNase失活。酶切时，TE也会有一定影响，但你可以将溶解DNA时的TE少加点。 酶切时，取的DNA的体积就可以减少，经水稀释，就问题不了。 RNA 的去除：一般将RNase加到TE中，经过37度温育一段时间就可以将RNA很好的去除1－2个小时就行。 酚的污染：首先在用酚仿抽提时，就要小心不要吸到下面的有机溶液，要是为了保险可以再用氯仿单独抽提一下，就可以很好的避免酚的残留。 高盐的去除： 提取质粒时一般盐的浓度很高，若有人在70％乙醇洗盐这步不做，也会影响后面酶切。 （2）PCR产物 PCR产物经电泳检测是单一目的条带可以直接酶切，若是杂带很多，就要将目的片段回收再酶切。一般在设计引物的时候，会在5端引入酶切位点，但是不要忘了在酶切位点外面加几个保护碱基。加入4个比较保险，如果没有保护碱基，内切酶是无法切断DNA的，即使加入保护碱基，酶切效率也会较低， 需要长时间酶切。 （3） 基因组DNA 将基因组做酶切一般是在southern blot 时常用，这时酶切体系一般较大，因为基因组中目的基因 的比例是很小的，酶切之后转膜又会有损失，因此多做一点酶切产物，才会获得较好的杂交效果。内切酶也要多加一些，一般都要酶切一夜，才能完全酶切。 2 酶切试剂 （1）酶切缓冲液：一般公司会给你的说明书中，告诉你用哪种缓冲液，如果是单酶切，按照说明书上提示即可。要是双酶切，原则是先找两种酶有没有可以共用的缓冲液，最好两种酶同时酶切比较省事。实在是两种酶没有共用缓冲液，就得先进行低盐缓冲液酶切，补充适量盐溶液，再行高盐的缓冲液进行酶切 。 （2）限制性内切酶：一般是在－20度保存，吸取时，从冰箱取出后放在冰上进行操作，而且动作要快，防止酶失活。有的人， 将酶分装几管，每次拿出一管来用，可以更好的避免酶失活。国产的内切酶，比如常用的EcoRI BamHI还可以，但是其他一些酶质量不如国外的可靠，有时你的酶切若出现smear的现象时，总是找不到原因，有可能就是酶中的污染。 3 酶切目的 （1）加入多少目的DNA,这要看你的酶切目的是什么,如果你要是回收目的片段，当然是多一些好，而且在电泳之前要更换电泳液，以免污染。要是只进行酶切鉴定，就可以少加一些目的片段。 （2）如果单一的目的片段酶切连接，在 酶切之后要将酶进行加热失活，或者用酚氯仿进行抽提，纯化。 （3）要获得不完全酶切的产物，一般都是控制酶切的时间，进行梯度延长酶切，可以获得你所要的最佳酶切时间。 4 酶切温度 一般常用的内切酶都是在37度是最佳的酶切反应温度，也有一些酶是低温活性更好，有的是28度 【酶切问题讨论专栏】 【酶切问题讨论专栏】 如何选择酶切缓冲液，如何提高酶切效率，尤其是PCR产物的酶切、双酶切、特殊酶切，总结了以下几点，希望对大家有帮助，欢迎补充！1.PCR产物的酶切。PCR产物的酶切与引物上引入的保护碱基有很大的关系，所以设计引物的时候就应该注意到这一点，如何选择保护碱基，具体参见NEB网站上关于保护碱基的资料:PCR产物的酶切相关的帖子：/bbs/actions/archie/post/242899_1.html/bbs/post/iew?bid=64id=818980tpg=1ppg=1sty=1age=0#818980/bbs/post/iew?bid=64id=620693tpg=1ppg=1sty=1age=0#620693/bbs/post/iew?bid=64id=720799tpg=1ppg=1sty=1age=0#7207992.加了保护碱基可能也会遇到切不动的问题，切不动可以从以下方面考虑：（1）酶切缓冲液。每种酶都有公司提供的最佳缓冲液，它们的差别只是离子浓度与体系的不同，如Na、k、Mg等，还有PH值及缓冲体系（一般Tris-HCl），另外酶加甘油和DTT作为保护剂。在双酶切的时候常会遇到两种酶有各自的缓冲液，要达到高酶切效率，选择是个问题，如果酶切时间和量足够，解决的方法：（A）使用其中一个酶的缓冲液，但要考虑到另一酶的反应效率，反应效率如何，可以查查酶在不同buffer里的效率参数，具体见公司网站，如NEB提供了很好的buffer参数: