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人牙龈成纤维细胞体外培养和生长曲线测定【摘要】 目的：体外培养正常人牙龈成纤维细胞并测定其生长曲线，初步了解该细胞生物学特性。方法：用改良组织块法培养人牙龈成纤维细胞，通过MTT比色法研究细胞的生长曲线。结果：改良组织块法原代培养细胞成活率达80％，培养细胞呈梭形，从第3天呈对数生长，第4－5天进入平台期。结论：改良组织块法能简便快速地获得人牙龈成纤维细胞，初步了解其生物学特性 【关键词】 人牙龈成纤维细胞 组织培养 生长曲线 人牙龈成纤维细胞（human gingival fibroblasts, HGFs）是牙龈固有层结缔组织的主要组成细胞，不仅具有活跃的自身更新能力，而且具有合成和降解胶原、弹力纤维、糖蛋白等细胞外基质的功能[1]。本实验采用改良组织块培养法进行人GFs的原代培养，研究其生物学特性，为进一步研究做好准备 1 材料和方法 1.1主要试剂和仪器 DMEM培养液(Gibco，美国)，胰蛋白酶(Gibco，美国)，胎牛血清FBS(天津灏洋生物公司)，超净工作台(上海力申科学仪器有限公司)，CO2孵箱( Heraeus，德国)，倒置相差显微镜(广州光学仪器厂)，MTT (Sigma,美国)，酶联免疫检测仪(Human 德国) 1.2方法 1.2.1 原代培养 选取本院需行阻生牙拔除的患者，在征得患者同意后在术中切取小块牙龈组织。要求患者没有牙龈增生、炎症及使用过导致牙龈增生的药物。术前将拔牙器械及术区周围消毒灭菌，无菌条件下获取小块牙龈组织（约3mm×3mm）[2]，立即放入装有无血清DMEM培养液的小瓶中，在超净工作台内用含有抗生素(青霉素100u/ml，链霉素100μg/ml)的PBS反复冲洗，用锐利小剪刀尽量去除牙龈上皮，在玻璃皿上剪成1mm3左右的碎块，均匀铺于六孔培养板底面，其上覆盖XX年来，牙龈成纤维细胞体外培养模型常常用来研究牙周发病机制和治疗[3、4] 实验采用本实验室改良的组织块法进行人牙龈成纤维细胞的原代培养，培养成功率高[5]。由于实验中取得牙龈组织来源较丰富，在细胞培养中组织块多的培养容易成功[6]。细胞培养成功的前提是细胞附着于壁上，利用盖玻片轻压组织块的方法能有效防止组织块漂起，培养板和玻片的组织面能形成更多的细胞贴附面，更利于细胞更好的贴壁生长及繁殖。而且，为提高培养成功率培养液应使用适当的血清浓度，大多数文献报道使用10％胎牛血清，本实验使用该浓度也取得较好的效果[7] 在将组织块进行剪切成小块的过程中尽量去除上皮组织，由于牙龈组织的结构特殊性，上皮钉突多而细长，较深地插入固有层中，并不能完全去除，因此在原代培养时细胞的成分较杂，随着消化和传代，上皮细胞减少而成纤维细胞大量繁殖 通过生长曲线测定，我们发现细胞在传代后第1－2天生长较为缓慢，自第三天起细胞分裂增殖活跃，生长迅速，进入对数生长期，在第4天时可达最高峰，当细胞生长接近饱和时，生长速度明显减缓，可见其生长呈现“滞缓－对数生长－平台”模式[8] 实验通过改良的体外培养方法，简便快速地获得人牙龈成纤维细胞并初步了解其生物学特性，为将来进行相关的研究奠定了基础 参考文献 〔1〕Hoang AM, Chen D, Oates TW, et al. Development and characterization of a transformed human periodontal ligament cell line. J Periodontol, 1997, 68(11): 1054. 〔2〕Somerman MJ, Archer SY, Imm GR et al. A Comparative study of human periodontal ligament cells and gingival fibroblasts in vitro. J Dent Res, 1988; 67(1): 66. 〔3〕Ohazama A, Isatsu K, Hatayama J, et al. Periodontal tissuenegeneration using fibrin tissue adhesion material in vitro and in vivo. Periodont ClinInvestig, 1996,18(1): 26. 〔4〕Feng F, Liu CM, Hsu WC, et al. Long-term effects of gingival fibroblasts-coated hydroxylapitite graf on periodontal osseous defects. J Formos Med Ass