荧光动力学法测定超氧化物歧化酶的活性.pdfVIP

第36卷 分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告 第4期 2008年4月 ChineseJournalofAnalyticalChemistry 489～493 荧光动力学法测定超氧化物歧化酶的活性 杨磊1，2 陈冠华“ 崔建超2 郝庆红1 李佳1，2 郭云霞1 (河北农业大学生命科学学院1，食品科技学院2，保定071001) 摘要超氧化物歧化酶的活力可以反映机体清除氧自由基的能力，在抗衰老研究中经常需对其进行准确 测定。邻苯三酚自氧化可产生强荧光的醌，超氧化物歧化酶通过清除该反应过程中产生的超氧阴离子自由基 使醌减少，据此建立了测定超氧化物歧化酶活力的荧光动力学方法。探讨了缓冲液的浓度、pH值、邻苯三酚 浓度和温度对测定的影响。在Tris·HAC缓冲液浓度为0．1mol／L、pH8．2、邻苯三酚浓度为0．385mmol／L、温 度为25℃的最佳条件下，得到SOD的线性响应范围为0．31—1．58 me／L；血清样品测定的RSD为1．12％ (n=5)；加标回收率在94．3％一103．49％之间。本法与黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶法的测定结果一致，可用于动 物样品中超氧化物歧化酶活力的测定。 关键词邻苯三酚自氧化，超氧化物歧化酶活力，荧光动力学法 1 引 言 dismutase，SOD) 衰老的自由基学说认为，随着年龄的增长，体内包括超氧化物歧化酶(superoxide 在内的抗氧化酶系统清除氧自由基的能力逐渐下降，从而引起氧自由基及脂质过氧化产物日益增多，最 终导致机体衰老和老年性疾病的发生。因此，SOD的活力和含量在一定程度上反映了机体清除氧自由 基的能力。对其进行准确测定，在抗衰老研究中具有重要意义。在已报道的测定SOD活力的方法中， 采用的超氧阴离子(．O：一)产生体系一般为黄嘌呤一黄嘌呤氧化酶法‘1·21、肾上腺素法m51和邻苯三酚 自氧化法‘6“11等，测定方法则多为紫外可见分光光度法口，弘n1。 在弱碱性介质中，随着pH值的增大，邻苯三酚可在羟基H+发生离解时与溶液中的溶解氧反应生 成半醌自由基，并产生·O：一；然后半醌自由基可进一步被·O：一氧化成具有强荧光的醌，如下式所示： H H H ．‘ 甲H Ol O OI O‘o． O ‘OH 。OH OH ‘O 如果溶液中含有SOD，则·O：一一经产生即被SOD清除，半醌自由基不能形成强荧光的醌，检测到 的荧光强度将比无SOD时减弱，且减弱的程度与SOD的浓度或活性有关。依据此原理可对SOD的活 性进行测定。 ’ 2 实验部分 2．1仪器与试剂 恒温水浴锅(江苏金伟实验仪器厂)。 SOD购白天津生命科学应用研究所，活力为6300U／rag；邻苯三酚，(天津市科密欧化学试剂有限公 四乙酸二钠(EDTA—Na2，99．0％，天津市恒兴化学试剂制造有限公司)均为分析纯试剂；水为二次蒸馏水。 2．2实验方法 2．2．1试剂和样品的制备准确称取0．0631 mL水中，放人密闭的棕色瓶中，于 g邻苯三酚，溶于50 4℃冰箱中保存，此溶液含0．01mol／L邻苯三酚；称取6．057gIris及0．3722gEDTA·Na2，溶于水中，用 2007-08-23收稿；2007-09-26接受 本文系河北省自然科学基金(No．202281)资助项目 ●E·mail：eghcycby@163．IN)m 490 分析化学