2016生物化学（高教版）教案：实验九 酵母蔗糖酶(最后) .docVIP

实验九 酵母蔗糖酶(最后) 实验九 酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究 本实验为学生提供一个较全面的实践机会，学习如何提取纯化、分析鉴定一种酶，并对这种酶的性质，尤其是动力学性质作初步的研究。 自1860年Bertholet从酒酵母Sacchacomyces Cerevisiae中发现了蔗糖酶以来，它已被广泛地进行了研究。蔗糖酶（invertase）（(—D—呋喃果糖苷果糖水解酶）（fructofuranoside fructohydrolase）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的(—呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。 本实验提取啤酒酵母中的蔗糖酶。该酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧，在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶（external yeast invertase）, 其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50% 糖成分的糖蛋白。在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶（internal yeast invertase），含有少量的糖。两种酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体，两种形式的酶的氨基酸组成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，Ser和Met，它们的分子量也不同，外酶约为27万(或22万，与酵母的来源有关)，内酶约为13.5万。尽管这两种酶在组成上有较大的差别，但其底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实验未区分内酶与外酶，而且由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取纯化的主要是外酶。 两种酶的性质对照表如下： 名称 MW 糖含量 亚基 底物为蔗糖的 Km 底物为棉子糖的Km 等电点 pI 最适 pH 稳定 pH 范围 最适温度 外酶 27万(22万) 50% 双 26mM 150 mM 5.0 4.9(3.5～5.5) 3.0～7.5 60℃ 内酶 13.5万 ＜3% 双 25mM 150 mM 4.5(3.5 ～5.5) 6.0～9.0 实验中，用测定生成还原糖（葡萄糖和果糖）的量来测定蔗糖水解的速度，在给定的实验条件下，每分钟水解底物的量定为蔗糖酶的活力单位。比活力为每毫克蛋白质的活力单位数。 本实验共有九个分实验： 一、蔗糖酶的提取与部分纯化 二、离子交换柱层析纯化蔗糖酶 三、蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定 四、反应时间对产物形成的影响 五、pH对酶活性的影响和最适pH的测定 六、温度对酶活性的影响和反应活化能的测定 七、底物浓度对催化反应速度的影响及米氏常数Km和最大反应速度Vmax的测定 八、尿素（脲）抑制蔗糖酶的实验 九、棉子糖和果糖抑制蔗糖酶的实验 （一） 蔗糖酶的提取与部分纯化 一、实验目的： 学习酶的纯化方法，并为动力学实验提供一定量的蔗糖酶。 二、试剂： 1. 啤酒酵母 2. 二氧化硅 3. 甲苯（使用前预冷到0℃以下） 4. 去离子水（使用前冷至4℃左右） 5. 冰块、食盐 6. 1N乙酸 7. 95%乙醇 三、仪器： 1. 研钵1个 2. 离心管3个 3. 滴管3个 4. 量筒50ml 1个 5. 水浴锅1个 6. 恒温水浴 7. 烧杯100ml 2个 8. 广泛pH试纸 9. 高速冷冻离心机 四、操作步骤： 1. 提取 （1）准备一个冰浴，将研钵稳妥放入冰浴中。 （2）称取5g干啤酒酵母和20g湿啤酒酵母，称20mg蜗牛酶及适量（约10g）二氧化硅，放入研钵中。二氧化硅要予先研细。 （3）量取预冷的甲苯30ml缓慢加入酵母中，边加边研磨成糊状，约需60分钟。研磨时用显微镜检查研磨的效果，至酵母细胞大部分研碎。 （4）缓慢加入预冷的40ml去离子水，每次加2ml左右，边加边研磨，至少用30分钟。以便将蔗糖酶充分转入水相。 （5）将混合物转入两个离心管中，平衡后，用高速冷离心机离心，4℃，10000rpm，10min。如果中间白色的脂肪层厚，说明研磨效果良好。用滴管吸出上层有机相。 （6）用滴管小心地取出脂肪层下面的水相，转入另一个清洁的离心管中，4℃，10000rpm，离心10min。 （7）将清液转入量筒，量出体积，留出1.5ml测定酶活力及蛋白含量。剩余部分转入清洁离心管中。 （8）用广泛pH试纸检查清液pH，用1N乙酸将pH调至5.0，称为“粗级分I”。 2. 热处理 （1）予先将恒温水浴调到50℃，将盛有粗级分I的离心管稳妥地放入水浴中，50℃下保温30分钟，在保温过程中不断轻摇离心管。 （2）取出离心管，于冰浴中迅速冷却，用4℃，10000rpm，离心10min。 （3）将上清液转入量筒，量出体积，留出1.5ml测定酶活力及蛋白质含量（称为“热级分II”）。 3. 乙