腈水合酶的分离纯化研究论文.pdfVIP

L021 腈水合酶的分离纯化研究* 1 1 1 廖春燕 郑裕国 沈寅初 1 （浙江工业大学生物工程研究所 ，浙江 杭州 310032 ） 摘要 腈是一类重要的化合物,它的酶法水解反应被广泛应用于氨基酸、酰胺、羧酸及其衍生物的 合成,在有机合成中占有极其重要的地位。利用微生物产生的腈水合酶对腈进行催化水合反应，使 其转变成相应的酰胺或者酸，这一路线因其具有较高的经济价值和学术价值日益受到人们的关 注。腈水合酶 （NHase ）应用于有机合成中最成功的例子就是被广泛用于丙烯酰胺的大规模生产， 取代了传统的化学法生产。本文对于腈水合酶分离纯化及其酶学特性的研究，不仅可加深对腈酶 反应的认识,丰富酶学理论,而且可拓展腈类化合物生物催化这一领域的范围,深化生物催化理论。 在应用上，通过对酶的分离纯化，获得的结晶体的酶制剂有利于酶的构象分析和下游蛋白质组学 研究，并应用于工业生产中，具有较大的经济效益。本研究主要从上海农药所的Nocardia sp.163 菌株出发，纯化过程包括超声波破碎、（NH ）SO 分级沉淀、透析、强碱性阴离子交换层析、 4 2 4 Sephadex G-100 凝胶过滤。分离过程所用的缓冲液为pH7.5 的50mMTris/HCL 。实验结果表明： 经纯化后的腈水合酶比活力高，纯化倍数达到20 倍左右。分析结果显示，腈水合酶的最适pH 值 为7.2 －7.5 左右，最适反应温度为32℃。腈水合酶在Ph6 －8 之间较为稳定，过酸或过碱酶活损 失比较大。而且腈水合酶的热稳定性比较差，高温条件极易热变性。 关键词 腈 腈水合酶 分离纯化 中图分类号 TQ92 文献标识码 A 文章编号 [1] 腈类化合物是一类重要的化合物，它的催化反应被广泛应用于工业生产 。腈水合酶 （Nitrile Hydratase ，简称NHase ）是一种微生物酶，它可催化多种腈类化合物转化为相应的 酰胺[2] 。其反应方程式为： Nitrile Hydratase Amidase R C N R CONH2 R CO2H + NH3 腈水合酶由两个亚单位( α, β)组成，并含有三价铁或钴离子，这些离子与α亚单位结合 形成的活性中心位于α、β亚单位的交界处，对腈的水解起催化作用。 随着生物技术的发展，发现能降解腈化物的微生物种类和数量越来越多，可被生物降解 的腈化物的结构类型也不断增加。应用微生物转化丙烯腈生产丙烯酰胺就是一个典型的成功 的例子[3 。丙烯酰胺是一种用途广泛的精细化工产品，主要用于生产聚丙烯酰胺。聚丙烯酰 2004-05-25 收到初稿，2004-收到修改稿. Received date: 2004-05-25 联系人: 郑裕国. 第一作者: 廖春燕，女，25 岁，硕士研 Corresponding author: Prof. ZHENG Yuguo. E-mail: 究生。 zhengyg@zjut.edu.cn Foundation item: supported by the National Major B asic 基金项目: 国家重点基础研究发展规划项目 Research Development Program (No.2003CB