应用抑制性消减杂交技术克隆和筛选HBV XTP12蛋白反式激活基因的上调基因.pdfVIP

298 · InfectDisInfo，2008，Vo1．21，No．5 · 应用抑制性消减杂交技术克隆和筛选 HBVXTP12蛋白反式激活基因的上调基因 宫 熳 成 军① 刘 妍 纪 冬 李 筠 解放军第三。二医院 北京 100039 ①北京市地坛医院 北京 100011 摘 要 目的 克隆并筛选乙型肝炎病毒 (HBV)反式激活基因XTP12的上调基因，了解其可能存在的调节功能。方法 应 用抑制性消减杂交技术克隆并筛选XTP12反式激活的新型靶基因。以XTP12表达质粒 pcDNA3．1(一)-XTPI2转染HepG2细 胞，以空载体 pcDNA3．1(一J为平行对照，制备转染后的细胞裂解液，提取mRNA并逆转录为eDNA，经 Rsal酶切后，将实验组 cDNA分成2组，分别与2种不同的接头衔接，再与对照组cDNA进行 2次消减杂交及2次抑制性聚合酶链反应 (PCR)，将产 物与pGEM—Teasy载体连接，构建eDNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源 性分析。结果 成功构建人XTP12反式激活基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后得到68个阳性克隆，进行菌落PCR 分析，均得到200～1000bp插入片段。随机挑选其中28个插入片段测序，并通过生物信息学分析获得其全长基因序列，结果共 获得28种编码基因，其中26种为已知基因编码蛋白，2种为未知功能的新基因。结论 筛选到的cDNA全长序列，包括一些与 细胞生长调节、物质代谢、免疫及肿瘤等密切相关的蛋白编码基因，推测了XTP12可能存在的调控机制的线索。 关键词 乙型肝炎病毒 ；X蛋白；反式激活；抑制性消减杂交 中图分类号：R512．62 文献标志码：A 文章编号：1007—8134(2008)05-0298—03 Cloningandscreeningoftheup-regulatedtargetgenes transactiVatedbyXTP12proteinofHBV by suppressionsubtractivehybridization GongMan，ChengJun~,LiuYan，eta1． 302HospitalofPLA，Beijing100039，China ~DitanHospital，Beijing100011，China Abstract Objective Tocloneandscreentheup-regulatedtargetgenestransactivatedbyxTP12proteinofHBVandexplorehteir regulatoryfunction．Methods Suppressionsubtractivehybridizati0n(SSH)wasusedtoclonenadscreenhtetargetgenestransactivatedby XTP12protein．pcDNA3．1(一)一xI’P12wastransfectedintoHepG2ceHs，wihtpcDNA3．1(一)emptyvectorascontro1．mRNAwasisolated andconvenedintocDNA．AfterrestrictionenzymeRsaIdigestion．testercDNAWas dividedintotwogroupsandligatedtothespecific adaptorlandadaptor2。respectively．TestercDNAWas hybridizedwihtdrivercDNAtwiceandunderwentpolmy erasechainreaction(PCR) wtice．andthenwas