胰岛素样生长因子基因表达与人类植入前胚胎发育的研究.pdfVIP

胰岛素样生跃因子基因表达与人类植入前胚胎发育的研究 中文■蔓 胰岛素样生长因子基因表达与人类植入前 胚胎发育的研究 硕士研究生：王丽娟 导 师：周灿权教授 中山大学第一附属医院生殖医学研究中心 中文摘要 研究目的 应用巢式RT--PCR方法检测人卵母细胞及各发育阶段的人类植入前胚胎中 IGF-I及IGF—II的表达，探讨其在植入前胚胎发育中的生物学意义。通过荧光定 量RT-PCR的技术，建立单个植入前胚胎的mRNA定量的检测方法，并同时探 讨IGF-II的表达与人植入前胚胎质量的关系。 第一部分 胰岛素样生长因子在人植入前胚胎细胞中的表达 材料： 收集2004年4月～7月于中山大学第一附属医院生殖中心行常规ⅣF和ICSI 患者不受精的成熟卵母细胞25个。收集2004年4月～7月于中山大学第一附属 医院生殖中心行常规IVF和ICSI患者及PGD后不适合移植及冷冻保存的胚胎 续培养得到桑椹胚10个、囊胚12个。 方法： 单个细胞裂解液制各卵母细胞及胚胎总RNA；逆转录合成cDNA；巢式PCR 胰岛素样生长因子基因表达与人类植入前胚胎发育的研究 中文麓蔓 选择扩增IGF—I及IGF一Ⅱ基因，内参照选择基因13-actin。扩增产物行琼脂糖凝胶 电泳。 结果： 人类未受精的卵母细胞及植入前各阶段胚胎(2细胞期、4细胞期、6细胞 期、8细胞期、桑椹胚及囊胚)均未检测到的IGF-I表达，而所有的卵母细胞及 胚胎均有IGF一1I的表达。 第二部分 胰岛素样生长因子-II基因表达与人植入前胚胎的质量的研究 材料： 收集2004年4月～7月于中山大学第一附属医院生殖中心行常规IVF和ICSI 患者及PGD后不适合移植及冷冻保存的胚胎172个。其中3PN胚胎44个，2PN 胚胎128个。每一个胚胎均进行常规的胚胎评分(包括原核期评分和第三天的细 胞数及分级)。 方法： 首先建立荧光定量RT-PCR检测IGF-IImRNA标准曲线，单个细胞裂解液制 备植入前胚胎的RNA，逆转录合成cDNA后进行荧光定量PCR反应，反应结 束，真接机器阅读荧光结果。Macintosh电脑根据阳性定量模板和待测样品的扩 增情况，算出反应体系中待测样品中eDNA的拷贝数。 结果： 按细胞数对胚胎进行分组后，2PN胚胎中细胞数≤4个、细胞数5～6个、细 胞数≥7三组之间IGF—IImRNA含量是有差异的(P0．01)：3PN胚胎中三组之间 IGF—II mRNA mRNA含量是没有统计学意义的(P均O．05)。来源于妊娠组胚胎中IGF—n 含量较非妊娠组的胚胎显著增高(P0．05)。人类植入前胚胎IGF—IImRNA的含 量与患者年龄呈负相关(相关系数R=·0．323，p=0．042)。来源于原发不孕和继 Ⅱ 胰岛素样生长因子基因表达与人类植入前胚胎发育的研究 中文■夏 发不孕患者的胚胎中IGF—IImRNA含量差别没有统计学意义(P=0．487)；来源 于常规IVF或ICSI患者的胚胎中IGF—IImRNA含量是没有差别的(P=0．950)；患 者的不孕年限于其胚胎中IGF—IImRNA含量无相关性(相关系数R=0．093， P=O．569)。 结论 1． 人类未受精的卵母细胞及植入前各阶段胚胎均未检测到IC珩一I表达，而所有 的卵母细胞及各阶段胚胎均有IGF—II的表达。 2．荧光定量RT-PCR技术可用于检测单个植入前胚胎的mRNA含量，从而可作为 一个更为精确的进行胚胎早期发育调控研究的实验工具。 3． IGF—II可作为胚胎质量的标记物；IGF一Ⅱ基因表达量和胚胎的形态学评分 呈乖相关。 4．年龄较轻和妊娠的病人中其胚胎中IGF—II的基因表达量较高。 关键词： 胰岛素样生长因子 植入前胚胎 荧光定量RT-PCR