重组人血管内皮生长因子165腺病毒载体的构建与鉴定.pdfVIP

医 盘查(电王 ) !生 旦箍 鲞筮 期 ChinJClinicians(ElectronicEdition)，January15，2012．Vo1．6．No．2 · 论 著 · 重组人血管 内皮生长因子 165腺病毒载体的 构建与鉴定 何春耒 刘午阳 姬广林 王茂源 肖文德 吴东保 何澄 叶勇军 莫建文 高辉 【摘要】 目的 探讨构建携带人血管内皮细胞生长因子(hVEGF)的重组腺病毒载体，为进一步的基因 转染构建组织工程骨的血管化提供实验基础。方法 采用RT—PCR扩增的方法获得人源性的hVEGF165，并 克隆入穿梭质粒 pAdTrackCMV。构建的质粒 pAdTrackCMV—VEGF165经酶切及测序鉴定正确后，通过 pAdeasy1质粒的介导与腺病毒包装质粒pAdTrackCMV—VEGF165共转染至人胚肾细胞 HEK293，经同源重 组后获得携带人VEGF的重组腺病毒pAdTrackCMV—VEGF165。应用PCR鉴定重组腺病毒，空斑传代纯化病 毒并反复冻融扩增病毒，测定病毒滴度。结果 PCR鉴定证实重组腺病毒含有人VEGF，病毒滴度为0．5× 10“pfufml。结论 成功构建的携带人VEGF的重组腺病毒载体能在 HEK293细胞 内扩增获得足够高的病 毒滴度，为基因治疗构建组织工程骨血管化的研究奠定基础。 【关键词】 血管内皮生长因子； 转染 ；腺病毒科；组织工程 Construction and identification of recombinna t humna vascular endothelial growth factor 165 gene adenoviralvector HEChun—lei，LIU Wu—yang，JlGuang—lin，WANGMao—yuan，XIAOWen—de， D0 一bao，HE Cheng，YEy0凡g-jun，MOJian—wen，GAOHui．DepartmentofOrthopedics，TheFirstAffiliatedHospitalofC-annan MedicalUniversity，Ganzhou341000，China Correspondingauthor：GAO Hui．Email：gaohui3721@126．con 【Abstract】 Objective Toconstructadenovirusvectorofthehumanvascularendothelialgrowthfactor (hVEGF)，forfurthergenetransfertoprovideanexperimentalbasisofconstructingtissueengineeringboneof vascularization．Mehtods AmplifiedhVEGF一165byRT—PCRmethod，andcloneditintothepAdTrackCMV shuttle plasmid．ToidentificationsequencingoftheplasmidsofpAdTrackCMV—VEGF165byrestrictionenzymedigestion．By pAdeasy1plasmidmediatedandadenoviurspackagingplasmidofpAdTrackCMV-VEGF165totransfectintohuman embryonickidneycellsHEK293，toobtainrecombinantadenoviurscarryinghumanVEGFpAdTrackCMV—VEGF一165 byhomologousrecombination．Identification ofadenoviursbyPCR，Plaque—purified viurspassaged，amplifiedviurs throughrepeated freezingand thawing，to determine theviurstiters．Results PCR confirmed thatrecombinant adenovirus containing the human VEGF gene．viurstiterwas0．5 ×10“pfu／m1．Conclusions Succes