转化生长因子-β1siRNA表达载体的构建.pdfVIP

2 ·论 者 · MayZU1，VO1．1U，NO．14 转化生长因子一I3 siRNA表达载体的构建 陆忠华 + 王建华 刘芬菊 搂奕青 (1苏 ,11大学附属常州肿瘤医院放疗科，江苏 常州213002；2苏州大学放射医学公共卫生学院，江苏苏州215123) 【摘要】目的 构建人转化生长因子 pl(TGF·p)基因siRNA质粒载体，为放射性肺损伤以及其他 TGF—p．高表达疾病的基因治疗提供 新的方法。方法 根据人 TGF一01mRNA序列为模板，设计合成相应的寡核苷酸序列，经退火形成双链 DNA片段 ，克隆到线性 pRNAT载 体 中，用酶切方法对重组体进行鉴定，最后将构建的TGF—D 特异性 siRNA质粒载体转染人胚肺成纤维细胞HFL—I细胞，通过通过荧光 定量PCR检测和 ELISA检测TGF一日mRNA和蛋 白的表达水平 ，以及流式细胞仪检测细胞凋亡 。结果 酶切和测序证实目的寡核苷酸 片段 已被准确克隆到线性pRNAT载体质粒 中，与对照组相比，TGF—D mRNA水平及蛋 白水平 的表达量均受到明显抑制 ，人胚肺成纤 维细胞凋亡明显增加，统计有显著性差异 (尸0．05)。结论 成功构建 了人TGF-D．基因siRNA质粒载体，对于放射性肺损伤以及其他 TGF—p 高表达疾病的基因治疗奠定了基础。 【关键词】转化生长因子一D ；siRNA；线性pRNAT载体 中图分类号：R-03 文献标识码：B 文章编号：1671—8194(2012)14-0002-04 ConstructionofTransformingGrowthFactor—BlsiRNAExpressionVector LU Zhong-hua1WANGJian—hualLIU Fen．| LOUYi．qingl ， IlDepartmentofRadiationOncology,ChangzhouTumorHospital,SuzhouUniversity,Changzhou213002．China,2SuzhouUniversiytRadiation Medicine,SchoolofPublicHealth，Suzhou215123，Chin A【bstract]OhjectiveToconstructaplasmidvectorofRNAinterference(RNAi)oftransforminggrowthfactorplgene(TGF·p1)，fortheradiation—induced lunginjurynadotherdiseases，highexpressionofTGF—pItoprovideanewmethodofgenetherapy．MethodsAccordingtohumanTGF—plmRNAsequence asatemplate，designandsynthesisofoligonucleotidescorresponding，thenDNAsegmnetwasgainedthroughannealingafterchemosynthesis，andthen wasclonedtopRNATvector．TherecombinantTGF—p1siRNAexpressionvectorwasevaluatedbyusingenzymecutting．Atlast，theconstructedplasmid TGF一13j—specificsiRNAvectorwastransfectedintohumanembryoniclungfibroblastHFL—Icells，anditseffectonTGF-BlmRNAexpressionwasobserved byfluorescencequnatitativePCRandELISA，apoptosisbyflowc~omeW ．ResultsDigestionandsequencingshowedth