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羊传染性脓疱病诊断及防治摘要：羊传染性脓疱病（Contagiouspustular dermatitis of sheep）俗称羊口疮（Orf），是由羊传染性脓疱病毒引起的绵羊、山羊的一种急性、接触传染性、嗜上皮性传染病。文章详细介绍了羊传染性脓疱病的诊断与防治。 关键词：羊传染性；脓疱病；诊断与防治 中图分类号：S858.26 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2010）-11-0203-1 羊传染性脓疱病病毒为痘病毒科（Poxviridae）副痘病毒属（Parapoxvims）成员。羔羊最为敏感，另外鹿、牛、人也可感染，是一种人畜共患病[1]。其临床症状主要表现为在绵羊、山羊的唇部、口腔黏膜、鼻部和乳房等部位的皮肤形成脓疱、丘疹、水泡和疣状痂皮，引起粘膜和皮肤的增生性变化。该病传染性极强，现呈流行趋势，在全世界养羊国家均有分布，给养羊业造成巨大的经济损失[2]。我国的青海、内蒙、甘肃、新疆、吉林等省份均有该病的发生和流行报道。2008年在吉林松原某羊场爆发该病，主要症状为典型的口疮型症状，现将具体的诊断与防治报告如下。 1 材料与方法 1.1 病料处理 采集患病羔羊唇部的痂皮材料于玛瑙研钵中，加0.01mol/L（pH7.2）PBS研磨成悬液，1000r/min离心20min，取上清，按20%比例加入浓度为10000 IU/ml的双抗（青、链霉素），4℃感作过夜后，-20℃保存备用，留作病毒接种液。 1.2 犊牛睾丸细胞的培养 无菌采取1日龄犊牛睾丸，用D-Hank′s液清洗2-3次；先将睾丸组织剪碎，再加入4-5倍体积的0.25%胰酶液进行消化，置于37℃水浴锅中消化30min，期间每隔10min振荡1次，然后加入血清终止消化；3000r/min离心10min，弃上清，再加入10%MEM冲洗，用4层无菌纱布过滤收集细胞悬液；最后按10%比例加入血清，置于37℃CO2培养箱培养。 1.3 病毒的分离培养 待犊牛睾丸细胞长满单层后，接种处理过的病毒液1ml，37℃吸附1h，弃上清后加入2%MEM，37℃培养，同时设正常细胞对照，每天观察细胞生长情况和细胞病变（CPE）。待细胞出现明显病变后，将出现病变的细胞病毒液反复冻融3次后收毒，置-20℃保存。 1.4 病毒粒子的电镜观察 将病毒细胞培养液反复冻融3次，3000r/min离心20min，取沉淀物进行电镜观察。 1.5 引物设计与合成 根据GeneBank上的基因序列设计一对引物[3]： 上游引物：GAAGAACTCGCCCGCCTGCTAAAAG 下游引物：ATGTGGCCGTTCTCCTCCAT 预计合成片段长度为1137 bp。 1.6 PCR扩增 以本次试验分离的羊传染性脓疱病毒基因组DNA为模板，进行PCR扩增。反应条件为94℃预变性3min，1个循环；然后进入98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸2min共30个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。 2 结果 2.1 细胞病变观察 长势良好的犊牛睾丸细胞接种羊传染性脓疱病毒液后，在18-24h开始肿胀、变圆；在变圆、肿胀后2-3h内细胞间质逐渐增宽，细胞开始分散并团缩，出现拉网，呈葡萄串状。随着病毒传代，细胞病变越来越明显和有规律性。 2.2 病毒粒子的电镜观察结果 提取病毒细胞培养液离心沉淀物，电镜观察。在负染标本中，病毒粒子呈椭圆型的线团样，病毒粒子长220nm,宽152nm，为典型的副痘病毒形状。 2.3 PCR结果 羊传染性脓疱病毒经PCR扩增后，在凝胶电泳后出现1条约1137bp的条带，与预期引物设计时的目的片段大小相等。 3 防治措施 3.1不要从疫区引进羊及其相关畜产品 如果引进外地羊，需先隔离观察3周，严格检疫、消毒，证明无病后方可混群饲养。一旦本地羊患病，对本群患病羊只应采取隔离措施，对接触过的用具，采取消毒处理，以防止疫情扩散。 3.2 减少饲料中的芒刺 做好圈舍无尖状物，以防止口腔黏膜和皮肤受损，保持自身抵抗力。 3.3 患病羊及羔羊不可继续哺乳 以防止病情扩散，分别采取人工哺乳处理。 3.4 进行疫苗接种 对本病流行区用羊传染性脓疱病毒弱毒疫苗进行免疫接种，以提高羊只的自身免疫力。 4 讨论 （1）在羊传染性脓疱病毒病毒培养的过程中，该病毒在犊牛睾丸细胞上产生的CPE与相关研究的报道相同。随着病毒在犊牛睾丸细胞上的传代，细胞病变越来越明显并具有规律性。但在电镜观察时，在羊传染性脓疱病毒细胞培养液3000r/min离心后的上清液中很难看到病毒粒子