一、 绪论与研究目的.pdf

一、 緒論與研究目的 在大腸桿菌外膜蛋白質家族中，OmpA 為主要蛋白質，功能 是維持大腸桿菌外膜的穩定性 (Wang, 2002)。先前研究指出 ompA 基因的表現受大腸桿菌轉錄因子 cAMP-CRP 所活化(Gibert and Barbe, 1990)，而 cAMP-CRP已知在大腸桿菌基因轉錄層次上扮 演重要角色，可調控超過百餘基因，藉由結合到基因啟動子鄰近 的區域，來增強或抑制該基因的表現 (Busby et al., 1999)。 Small noncoding RNA(sRNA)分子發現在微生物中，由一段 很短的 RNA 序列所組成，它不會轉譯任何蛋白質，主要功能為調 控 mRNA的轉譯與穩定性(G ottesman, 2004)。目前在大腸桿菌中 已經有超過 50 個以上的 sRNA 被發現與鑑定，大多數的 small RNA 藉由序列互補的方式與標定的 mRNA 作結合，影響該 mRNA 的轉譯 或穩定性。先前已有文獻報導 small RNA可調控基因，例如在細 胞內 Fe 缺乏時， sRNA RyhB 會降低 Fe儲存蛋白質基因的表現 (Mass´e and Gottesman, 2002) 。當細胞內葡萄糖增加時，Spot 42 sRNA 序列與 galK mRNA 互補，阻擋核醣體結合位置，間接增 加 GalE 與 GalK蛋白質的比例 (Moller et al., 2002)。而 sRNA 基因表現本身也受到調控，在不同環境條件下，sRNA在細胞中 的量也會有所不同，例如當大腸桿菌生長到穩定後期 (stationary phase)時， sRNA MicA會大量的被表現，影響 OmpA 蛋白質的表現 (Rasmussen et al., 2005)。 以往研究結果認為 cAMP 為細胞內轉錄因子 CRP 蛋白的輔因 子(cofactor)，與 CRP 形成 cAMP-CRP 複合物，在轉錄的層次上， ‐ 1 ‐    可活化或抑制基因的表現，此外 cAM P-CRP複合物藉由結合到 sRNA啟動子區域活化一些 sRNA 基因表現，例如：Spot42、 RyeE(Johansen et al., 2008)。而 sRNA在細胞內又與 Hfq 共同 作用，扮演著調控 post-transcription 層次上 mRNA的穩定性或 是轉譯。所以我們認為 cAMP 在 mRNA post- transcription 層次 上也具有間接調控的功能，作用機制可能是藉由影響 sRNA 或是 Hfq 所造成。此研究中我們將焦點擺在探討 post- transcription 層次上 ompA mRNA的穩定性，我們發現 cAMP 存在下，提升 ompA mRNA的穩定性，但此現象可能不是 cAMP 直接調控 ompA mRNA 的 穩定性，而是 cAMP 間接影響 sRNA 或是 Hfq 而造成。因此希望能 建立模式以了解 cAMP 影響 ompA mRNA穩定性相關的機制，進一 步了解大腸桿菌生理與基因調控的關係。                                         ‐ 2 ‐    二、 文獻回顧 2.1 外膜蛋白質 A (OmpA)結構 在大腸桿菌( Escherichia coli )外膜蛋白質家族(outer membrane proteins family)中，外膜蛋白質 A(outer membrane protein A ，OmpA)為主要外膜蛋白，大量出現在細胞外膜結構 上。OmpA蛋白質共由 347 個胺基酸所構成 (Sugawara and Nikaido,