禽网状内皮组织增生病病毒env基因的原核表达及其 - 中国畜牧业协会.pdf

禽网状内皮组织增生病病毒env基因的原核表达 及其多克隆抗体制备 李 凯，高宏雷，祁小乐，高玉龙，高 立，邓小芸，王笑梅 （中国农业科学院哈尔滨兽医研究所禽传染病研究室，兽医生物技术国家重点实验室， 哈尔滨 150001） 网状内皮组织增生症（reticuloendotheliosis ，RE ）是由网状内皮组织增生症病毒（REV ） 群的反转录病毒引起禽类的一群病理综合征，包括急性网状细胞肿瘤形成、矮小综合征和淋 [1] 巴组织与其它组织慢性肿瘤 。REV感染的自然宿主有火鸡、鸡、鸭、鹅等，REV感染后， 禽生长迟缓，淘汰率和死亡率升高；引起感染禽的免疫抑制，干扰其他的免疫效应，导致免 [2] 疫失败 。REV隶属于哺乳动物C型反转录病毒属，基因组大小为9.0kb ，主要编码蛋白包括 [3,4] 核心蛋白（gag ）、酶蛋白（pol ）和囊膜蛋白（env ） 。其中env基因编码两个糖蛋白gp90 [5] [6] 和gp20 ，gp90为表面蛋白，是病毒的免疫原蛋白，可诱导产生中和抗体 ，gp20为穿膜蛋 白，参与病毒感染过程中病毒粒子囊膜与宿主细胞膜的融合。 目前，REV在我国的流行越来越严重，在某些鸡场中REV 阳性抗体的检出率可高达 21.4%～71.0%[7] ，研究发现，不同毒株具有明显一致的抗原性。但迄今为止，我们对REV 还缺乏重视，缺少REV流行病学数据，对REV 的基础研究报道较少，REV诊断试剂昂贵，而 且目前世界上还没有商品化的用于预防REV 的疫苗，以上问题对REV 的进一步研究提出了新 的需求。本文通过原核表达系统成功表达了REV黑龙江分离株（HLJR0901 ）的env全长蛋白， 表达产物纯化复性后免疫小鼠，制备了高效价、特异性好的多克隆抗体，获得的env蛋白及 抗血清可用于REV 的诊断，另外，本研究为REV亚单位疫苗的研制打下了基础。 1 材料和方法 1.1 病毒株、质粒、菌株和实验动物 REV黑龙江分离株HLJR0901 由本实验室分离鉴定；pMD18T-env （HLJR0901 ）质粒由 本实验室构建、原核表达载体pET-32a （+ ）、大肠杆菌感受态细胞Top10F’由本实验室保存； 宿主菌BL21 （DE3 ）购自invitrogen公司；SPF雌性6～8周龄BalB/c小鼠由哈尔滨兽医研究所 实验动物中心提供。 1.2 主要试剂 PrimeSTARTM HS DNA Polymerase 、DNA Marker、限制性内切酶等购自大连宝生物工程 有限公司；AxyPrepTM plasmid miniprep Kit 、AxyPrepTM DNA Gel Extraction Kit购自Axygen 公司；T4 DNA连接酶、PageRulerTM Prestained Protein Ladder购自MBI公司；HisTrapTM kit 购自Amersham Biosciences公司；IPTG 、辣根过氧化物酶（HRP ）标记的兔抗鸡IgG 、辣根 过氧化物酶（HRP ）标记的兔抗鼠IgG、荧光素 （FITC ）标记的羊抗鼠IgG均购自Sigma公司； 鸡源REV多克隆抗体购自美国Charles River公司。 1.3 env基因的扩增 根据本实验室分离鉴定REV黑龙江分离株HLJR0901 的基因组序列，设计合成一对引物。 基金项目：现代农业产业技术体系建设专项资金资助（nycytx-42-G3-01 ） 作者简介：李凯 （1986 －），男，山东泰安人，硕士研究生，主要从事动物病毒学研究。 通讯作者：王笑梅，Tel E-mail ：xmw@hvri.ac.cn 。 上游引物（R0901envU ）：5′-CAGGAATTCATGGACTGTCTCACC-3′，下游引物（R0901envL ）： 5’-AGAGTCGACTTGACCTAGGGTATC-3’，其5′端分别设计有EcoR1和SalI位点 （下划线部 分）。以