2．酶处理法.ppt

2．酶处理法 用外来酶处理生物材料，如溶菌酶（Lysozyme）是专一地破坏细菌细胞壁的酶。如用噬菌体感染大肠杆菌细胞制造DNA时，采用pH8的0.1mol／L三羟甲基氨基甲烷（Tris）－0.01mol／L乙二胺四乙酸（EDTA）制成每毫升含2亿个细胞的细胞悬液， 然后加入100μg～ 1mg的溶菌酶，在37℃保温10min，细菌胞壁即被破坏；还有把蜗牛酶用于酵母细胞的破碎；用胰酶处理猪脑制备脑安素。用于专一性分解细胞壁的酶还有纤维素酶（破坏植物细胞）、细菌蛋白酶、酯酶、壳糖酶等。 3.表面活性剂处理法 表面活性剂的分子中，兼有亲脂性和亲水性基团，能降低水的界面张力，具有乳化、分散、增溶作用。较常用的有十二烷基硫酸钠(SDS)、氯化十二烷基吡啶、去氧胆酸钠等。 生化物质的提取 利用一种溶剂对不同物质溶解度的差异，从混合物中分离出一种或几种组分的过程称为提取（extraction），提取又称萃取或抽提，其含义基本相同。用冷溶剂从固体物质提取的过程可称为浸渍（maceration）；用热溶剂者可称为浸提（digestion），也称浸煮 一、物质的性质与提取 （一）物质的性质与提取方法的选择 选择合适的溶剂系统与提取条件。 （二）活性物质的保护措施 1．采用缓冲系统 2．添加保护剂（半胱氨酸，还原性谷胱甘肽等） 3．抑制水解酶的作用(SDS,EDTA) 4．其他保护措施(避免过酸过碱和剧烈搅拌 ） （三）生化物质的提取 一般生产上多用2～3次提取。溶剂用量（L）为生物材料的2～5倍，少数情况也有用10～20倍量溶剂作一次性提取。目的是节省提取时间，降低有害酶的作用。 二、影响提取的因素 （－）温度 （二）酸碱度 （三）盐浓度 四、提取方法 （—）用酸、碱、盐水溶液提取 （二）用表面活性剂提取 （三）有机溶剂提取 对酸性物质的提取，常在碱性条件下进行；对碱性物质的提取，常在酸性条件下进行；对两性物质的提取，则使水溶液的pH值在该两性物质的等电点附近为佳。 三、超临界气体的萃取技术 以气体为萃取剂，当气体处于超过临界温度和临界压力时，呈现一种既非液相又非气相的流体，兼有液体和气体的特性。如密度接近于液体，粘度却接近于气体，具有良好的溶剂性质。 气体萃取剂必须具有临界压力低，临界温度接近于室温，化学稳定性好，价廉易得等特点。主要有二氧化碳、氮气、乙烯、乙烷、丙烯、丙烷等，最常用的是二氧化碳。其方法主要有等温法和等压法两种，借助于压力或温度的调节分离萃取剂与被萃取物。 该技术应用于酶、不饱和脂肪酸的提取（如鱼油和卵磷脂的提取）、精制和回收，也可用于生化产品的溶剂脱除。某些生化产品在生产过程中，采用了丙酮和甲醇溶剂，欲脱去溶剂又要避免产品的分解，需选择超临界气体提取。与减压干燥法相比较，前者不多消耗能源，且缩短脱溶时间。 五、提取液的分离 提取所得到的溶液，需与固体或另一液体分离。溶液与固体的分离，一股处理方法有三种：自然沉降、过滤、离心。自然沉降是在液体介质中，固体自然下沉而分离的过程。当混悬液处理量较大，且固体和液体的比重悬殊时，可用此法。沉降分层后，可用虹吸等方法将液体部分移去。过滤系利用多孔材料阻留固体，而使液体 通过，达到固体与液体分离的过程。离心是利用旋转运动的离心力进行分离物料的一种操作，其中通过过滤介质分离液体和固体者为离心过滤；利用液体比重的大小分离出不同比重的液体者为离心分离；利用液固两相比重的差异进行沉降分离者为离心沉降。 生化物质的分离纯化技术 生化物质分离纯化技术包括：生化产品的分离分析和生化产品的制备。前者主要对生物体内各组份加以分离后进行定、定量鉴定，它不一定要把某组分从混合物中分离提取出来；而后者则主要是为了获得生物体内某一单纯组分。 为了保护目的物的生理活性及结构上的完整性，生物产品的制备中的分离方法多采用温和的“多阶式”方法进行，即常说的“逐级分离”方法。为了纯化一种生化物质常常要联合几个，甚至十几个步骤，并不断变换各种不同类型的分离方法， 才能达到目的。因此操的时间长，手续繁琐，给制备工作带来众多影响。亲和层析法具有从复杂生物组成中专一的“钓出”特异生化成分的特点，目前已在生物大分子，如酶、蛋白、抗体和核酸等的纯化中得到广泛应用。 一 分离纯化原理 （1）根据分子形状和大小不同进行分离。如差速离心与超离心，膜分离（透析、 电