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TRIzol RNA提取试剂 货号：M0901 描述：TRIzol是一种快速从组织细胞中提取总RNA的单相试剂。在样品裂解过程中TRIzol抑制RNA酶活性保持RNA完整性；加入氯仿后离心，RNA相将与DNA和蛋白质分离，随后用异丙醇沉淀RNA。如果需要还可以继续提取DNA和蛋白质。纯化的总RNA可用于RT－PCR、Northern Blot、RNA酶保护、Poly(A) mRNA纯化、体外翻译等实验。 储存4 oC密封避光保存两年有效。 适用(1) 固体组织 (100 mg /ml ): 人、动物、植物的各种新鲜或冻存组织。 (2) 培养细胞 (5~10 x 106细胞/ml): 真核细胞，细菌，酵母。 (3) 液体标本(100 μl/ml): 全血、体液、尿液，病毒样品等。 操作准备 极微量的RNA酶都会导致RNA降解。分离RNA时RNA酶污染主要来自以下五个方面：(1) 来自实验人员的双手。(2) 来自器皿、吸头离心管、自备液体。(3) 组织细胞破碎不可避免地释放内源RNA酶。(4) RNA未能完全与蛋白质分离。(5) RNA沉淀和溶解时来自吸头离心管和溶液。Trizol可抑制RNA酶活性因此在有Trizol存在的步骤中，使用高压消毒20分钟的吸头离心管和溶液即可胜任RNA提取操作。然而在RNA溶解之后，来自实验材料的RNA酶污染将会导致RNA降解，应严格使用高压灭活RNA酶的用品。戴手套无疑是有益的，但戴口罩和帽子则无必要。 固体组织破碎设备。准备下列装置之一，1)玻璃匀浆器。必要时泡酸清洁，用高压灭菌蒸馏水洗涤数次。2)研钵。适用于液氮冻存组织的研磨，清洗同玻璃匀浆器。3)组织细胞超声破碎仪器。探头插入装满蒸馏水的试管或烧杯中，开启超声清洗探头30秒至1分钟。4)高速机械匀浆器(Polytron，Tekmar或类似产品)。打开开关，在蒸馏水中清洗分散器头数次。高压蒸汽30分钟消毒一次性吸头离心管。RNA沉淀和溶解之后，应严格使用高压消毒的一次性用品。由于不可预测的原因，动物已经处死，组织已取出，细胞已收取，而吸头和离心管尚未高压处理。此时保险做法是使用普利莱基因技术公司的另种产品――组织RNA保护液(Cat# R1030)，用户可把来不及处理的标本保存在RNA保护液中，37 oC保存3天，25 oC保存2周，4 oC保存4周，－20 oC保存数月，固体或液体标本中RNA不会降解。 DEPC处理的双蒸水。加DEPC到水中至终浓度为0.01% v/v，室温过夜，高压消毒30分钟。用于溶解RNA，配制TE缓冲液和75％乙醇。 普通双蒸水。高压消毒30分钟，用于冲洗器皿，配制琼脂糖凝胶和电泳用缓冲液。注意溶液配制后高压灭菌，但琼脂糖不能高压处理。 冰盒和湿冰。在冰上进行操作有助于减少RNA降解。 异丙醇，氯仿，纯乙醇，分析纯。75％乙醇用高压消毒的蒸馏水配制。 其它用品。电泳槽，双蒸水冲洗。离心机和加样器，无需处理。 戴手套。注意某些实验如提取质粒DNA使用大量RNA酶，为防污染须特别清洗实验器具和实验区域。 RNA提取程序 1. 组织细胞破碎与裂解 冰上操作快速破碎组织至关重要。组织细胞过量不仅使RNA得率下降，还将导致DNA和蛋白质污染。 (1) 组织。按比例每50-100 mg组织加1 ml Trizol试剂。用研钵研磨：仅适用于液氮冻存组织。组织放在研钵中研成粉末，加1 ml Trizol试剂，继续研磨至组织完全裂解。用玻璃匀浆器匀浆：加入Trizol上下手动匀浆组织10-15次。用高速机械匀浆器：将组织放入塑料试管内，试管置冰浴烧杯中，加入Trizol试剂，将分散器头垂直插入管内与组织块接触，转速12,000-20,000 rpm，上下移动试管10-20次，直到组织完全打散，无肉眼可见大块。用超声仪：根据机器型号进行预试验，选取能有效破碎组织的功率和时间。 mg组织可获得足量的RNA，对绝大多数实验目的绰绰有余。加入过量组织或过少Trizol容易导致提取失败。(2)少量难以打碎的组织碎片不影响后续RNA提取。(3)用研钵和玻璃匀浆器匀浆破碎组织时，应略微多加一些裂解液，以补充裂解产物粘在容器壁上造成的体积丢失。 (2) 培养细胞。贴壁细胞：弃培养基，用PBS缓冲液冲洗细胞一次。每5-10(106个细胞加1 ml Trizol试剂，但Trizol加入量必须有效地覆盖瓶皿的细胞表面。一个75 cm2瓶皿的细胞通常需要2 ml提取液，一个35 cm2瓶皿的细胞需要 1 ml提取液，更小的培养瓶皿可使用更少的提取液，但后续操作会因体积过小而极为不便。晃动或用吸头吹打使提取液流过并裂解所有细胞。置冰上5分钟，倾斜瓶皿使粘稠的裂解物聚于一处以便取出。悬浮细胞：低速离心收集细胞，将细胞快速重悬于50-100(l的PBS或