蟾蜍毒素和华蟾素对H,22和S,180荷瘤小鼠的疗效及毒副作用的实验分析.pdfVIP

中文摘要 前 言 ， f蟾蜍毒素是传统中药蟾酥的主要有效成分，主要以蟾酥的脂 溶性成分为主，是一些具有相同骨架的甾族化合物，总称蟾蜍配基 (Bufodienolides)。近年来的研究发现，蟾蜍毒素在诱导细胞分化、 促进细胞凋亡、抑制血管生成、改变肿瘤细胞相关基因的表达等方 面发挥抗肿瘤的作用。本实验室的前期工作发现，部分分离纯化 的蟾酥的脂溶性成分(蟾蜍毒素混合物)可以明显抑制人类白血 的凋亡，诱导K562细胞发生G2／M期阻滞，OVCAR3细胞发生M 白的表达。但其主要的抗肿瘤成分及作用机制目前尚不十分清 楚。1 本实验的目的是用乙醇提取蟾蜍耳后腺及皮肤腺分泌物原 液，获得部分分离纯化的醇溶性的蟾蜍毒素混合物(以下简称蟾 蜍毒素)，并探讨蟾蜍毒素是否可抑制荷瘤小鼠体内肿瘤细胞的 生长，和在有效治疗剂量范围内对各内脏器官的毒副作用，来进一 步证实蟾蜍毒素的抗肿瘤作用。 ／实验材料与方法 ＼ 1．实验材料及仪器 1．1 中华大蟾蜍的耳后腺及皮脂腺分泌物原浆。华蟾素注 射液(安徽金蟾生化股份有限公司产品)。 1．2细胞株：H。小鼠肝癌细胞株，S。。。小鼠肉瘤细胞株，由中 ·1· 国药科大学提供，用昆明种小鼠传代保种。 1．3试剂：无水乙醇，蒸馏水，二甲基亚砜，RPMI一1640培养 基，10％胎牛血清，庆大霉素，肝素钠，硫化钠，H—E染色材料等。 3K30低温离心机，减压蒸馏装置， 1．4主要仪器：SIGMA CHRIST—LOC一1M真空冷冻干燥机，光学显微镜，医用净化工作 KX一 台，37度水浴箱，VITROS250全自动干化学分析仪，SYSMX 21全自动血球分析仪等。 1．5动物：昆明种小鼠由中国医科大学动物部提供。 2实验方法 2．1 蟾蜍毒素的制备：采用特殊工艺提取蟾蜍耳后腺及皮脂 腺分泌物，用双蒸馏水充分搅拌溶解后离心，沉淀物用无水乙醇溶 解后离心取上清，减压蒸馏，制成千粉称重，计算提纯百分率。 2．2肿瘤细胞的准备：取液氮保存的H篮、$180细胞复苏后，加 入含10％胎牛血清的RPMI一1640培养液，调整细胞浓度为5—6 x106个／ml，再加入肝素钠抗凝，庆大霉素预防感染。小鼠下腹 部碘伏消毒后，腹腔注射0。2ml细胞悬液，lO天后用细针头消毒 后取腹水，呈乳白色，用生理盐水稀释，调整细胞浓度5—6×106 个／ml，加入肝素钠和庆大霉素，准备接种昆明种小鼠。 2．3荷瘤小鼠的制备： 2．3．1 腹水瘤小鼠的制备：同上面细胞的准备，将调整好浓 度的细胞悬液0．2ml接种于小鼠的腹腔。 2．3．2实体瘤小鼠的制备：取小鼠，用脱毛剂褪净小鼠右下 肢外侧绒毛，用1rnl注射器皮下注射0．2ml计数好的细胞悬液。 2．4实验方法： 2．4．1蟾蜍毒素的亚急性毒性实验：取昆明种小鼠80只，18 —22克，分成7组(取蟾蜍毒素干粉用DMSO溶解后，用双蒸馏水 配制成不同浓度的蟾蜍毒素溶液，保证等容量注入)，按1mg／kg， 5rag／kg，10 mg／kg，40 mg／kg，20 mg／kg，80mg／kg，160 mg／kg给 ·2· 药，连续给药9天，次日处死，取内脏，作石蜡切片，H—E染色。 2．4．2腹水瘤小鼠实验方法：每次取昆明种小鼠80只，18～ 22克，腹腔接种$180小鼠肉瘤细胞，次日依体重分成7组，实验组 分别给予5mg／kg，0．5mg／kg，0．1mg／kg的蟾蜍毒素，阳性对照组 分别给予170 予0．5％的二甲基亚砜(DMSO)。连续给药9天后停药，观察小鼠 的生存时间，计算生命延长率。H：：接种方法同上，给药剂