生化实验讲座.doc

生物化学大实验讲稿---------- 离心分离血浆脂蛋白 [原理]:本实验采用正常人抗凝血浆，以NaBr为密度介质，利用各脂蛋白颗粒密度不同，经过等密度超速离心大量制备低密度血浆脂蛋白。 [操作步骤] 1．血浆准备：取血库血浆250mL 2．CM和VLDL分离： 血浆中加入适量的双蒸水，调节密度至1.019g/ml，分置于离心管中，加盖，用1.019g/ml密度液平衡，放入RP-50T转头，在8℃下40，000rpm离心20小时。CM和VLDL浮于离心管上层，用吸管小心吸取。 3．LDL分离：下层溶液中加入适量的NaBr，调节密度至1.060g/ml，分置于离心管中，加盖，用1.060g/ml密度液平衡，放入RP-50T转头，在8℃下40，000rpm离心,离心24小时。LDL浮于离心管上层，用吸管小心吸取。 4．透析：已分离好的各部分脂蛋白含有大量的NaBr，需要透析脱盐。将各脂蛋白溶液分别装入透析袋中，对抗0.01mol/L PBS（pH7.4）溶液透析过夜。 5．浓缩：将透析过夜的脂蛋白溶液连同透析袋一起放入盛有40%的PEG20000的烧杯中，浓缩至适当体积。 [详细操作步骤]： 1．血浆准备：取血库血浆250mL ，提前一天放入冰箱4℃冷藏 2．CM和VLDL分离： 1）取约250ml血浆置于250ml量筒中，加入适量的双蒸水（放入密度计时液体离量筒管口约1厘米），调节密度至 1.019g/mL，（比重计 1.000～1.1000）分置于8个离心管中，加液体离管口5－8 mm,盖好盖子，并在相关器械内（盖盖子器）检查是否盖好，如盖好，则用注射器加入调好的血浆（密度1.019g/mL），加满，小螺丝盖好（稍松），大螺帽适紧。将8支离心管两两平均分成4组，置于天平上平衡，两两调平衡后，盖好小螺帽（小螺帽有阻力就行），试管标记编号。 2）将离心管两两对应放入角度转头RT-50T内，注意在橡胶密封圈上涂油脂。 3）输入离心数据，编离心程序： ①离心机显示屏上有速度、时间、温度、加速、减速及功能设定，上面为实际的，下面为设定的。可根据自己的要求设定相关的参数。我们设温度在8℃，转速40000rpm，离心时间20－23小时，加速为9，减速为9。 功能function的设定有六个方面，常用的有RLM，键入enter则显示不同的转子，上下键选定自己要用转子，向下选出RP－50T，键入enter，显示转动还是创建或改变，还有删除,按自己需求设定，选出1.runing,再次键入enter，则屏幕下方显示你设定的转子，共转了多少转。我们可看到RP－50T共转了多少转。 4）在记录本上记录此转子总体使用的转数及时间。并记录其他相关信息。如姓名，年、月、日等等。 5)装转子，特别注意垂直放入，轻轻上下提几下，不要蹩着，看是否放好，切记：未放好则不要随意转动。 6）盖好离心机盖子，键入START,观察三项指标： ①真空的三个三角号是否达到。（先抽真空， vacuum为一个▲，速度可达4000转/分，accelerate变为wait等待符号，继续抽真空达两个▲▲号，则又出现accelerate，速度进一步加速到40000转/分，再等十几分钟，则vacuum出现三个▲▲▲。） ②温度是否逐渐降下来。 ③转速是否到达设定的转速。 并注意听有无异常的声音，如有则键入stop,查找原因。一般三项指标正常后再离开。 7）二日，离心机停下，按vacuum键进气，打开离心机腔体盖子，垂直提出转子。用小锣丝刀斜提试管从转子内取出。 8）取盖子时一手握着试管，另一只手向上提盖子，一只手顶着另一只手，一定小心，慢慢将盖子取掉。 9）CM和VLDL浮于离心管上层，发白的不透明乳液，用胶头滴管小心吸取，置于锥形瓶中密封保存（标记日期、样本名称--VLDL，4℃冷藏，全部实验结束后，用塑料瓶冷冻保存）。 3．LDL分离： 1）将8个离心管中的下层溶液取出，用滴管吸取离出的下清液多次清洗试管，将下层全部液体倒入烧杯中，加入磁子置于磁力搅拌器上混合均匀，将离心出来的下层不溶液体化开，然后将液体全部倒入250ml量筒中，加入适量的双蒸水（放入密度计时液体离量筒管口约1厘米），用药勺取适量的NaBr加入，将调节密度至1.063g/mL，分装液体至8只试管，加液体离管口约5－8 mm,盖好盖子，并在相关器械内（盖盖子器）检查是否盖好。如盖好则用注射器加入调好的血浆（密度1.063g/mL），加满，小螺丝盖好（稍松），大螺帽适紧，。将8支离心管平均分成4组，置于平衡天平上，两两调平衡，然后盖好小螺帽（小螺帽有阻力就行），试管标记编号。 2）用筷子夹着脱脂棉将离心机转子内的冷凝水沾干，然后将油脂少许涂于密封橡胶圈，将转子准备好。 3）将离心管两两对应放入角度转头后RT