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使用MST 在天然的生物溶液中测定分子间相互作用 摘要 在人体内的蛋白互作反应与在体外的情况是不同的。在研究蛋白功能和开发新药的时候这一 点是很重要的。在这篇文章中，我们介绍了一种高效 ，不限缓冲液的方法，即微量热泳动 方法，这种方法可以分析蛋白分子或者小分子在生物液中的相互作用，比如血清或者细胞裂 解液。这种技术以分子的热泳动为基础，提供了分子大小，电话和水化层方面的信息。我们 用免疫学相关系统，包括人体干扰素γ，以及钙调蛋白和钙离子的相互作用验证了这种方法。 小分子抑制剂橡黄素和它的激酶PKA 的亲和力分别在缓冲液和血清中进行测定，结果发现二 者的亲和力在血清中下降了400 倍左右。生物体液对亲和力的影响给予蛋白功能研究更可靠 的结论，有可能促进更多高效的药物开发。 结果 实验方法 实验设置是由红外激光通过红外分色镜被耦合至荧光激发/发射通道中而最终 完成成像（Fig. 1a）。激光通过物镜（此物镜也被用作进行荧光检测）聚集在样品上。这样 就能够在各种微流样品隔室里，比如毛细管或者微流通道里进行热泳动观察。使用 100um 直径的玻璃毛细管，以及500nl 的体积使得消耗的样品量很低，而且有很高的重复性。红外 激光在 25um 的长度范围内产生一个空间上的温度分布。温度与激光功率呈线性增长。在 150ms 后，激光加热与散热达到平衡，得到一个差不多 2-6K 的稳态的温度增加。温度上升 引导了一个空间上的浓度分布，这个是可以根据与荧光染料共价结合的互作分子的荧光变化 观察到的。一般来说，每个蛋白分子的一个伯胺会被标记，所以染料的位置也是呈统计学的 分布。考虑到一个典型的蛋白分子里的赖氨酸数量，我们可以认为标记会影响结合的机率是 很低的。大部分蛋白分子被标记在远离结合位点的位置上，影响结合反应的只是小部分。为 了测量蛋白分子的热泳动过程，我们对初始状态与稳态之间的浓度变化进行测量。所以可以 得到样品的两个图像：在激光加热前的初始状态的图像，显示的是分子的同质均匀分布；第 二个图像是激光加热数秒后的图像（Fig. 1b）。这么短的测量时间是足够的，因为在温度分 布的小空间内的质量扩散是很快的。即使在测量时间内分子扩散很慢，并且没有达到稳态， 浓度分布曲线在数秒后也是可以被辨识的。关闭红外激光加热，导致由于扩散运动引起的初 始同质均匀浓度曲线的回复，从而提供了分子扩散系数的信息。 Figure 1/MST 设置和原理. （a）实验方法. 使用一个额外的二向色镜插入到荧光显微镜中， 加热的红外激光聚集到内径有100um 的石英玻璃毛细管中。荧光样品通过CCD 成像。（b）荧 光图像. 图像通过时间形成。起初，荧光标记分子呈均匀分布。在打开红外激光加热后，分 子在温度梯度场中经历热泳动力，一般会从热区向外扩散。在稳定状态下，分子会通过质量 扩撒达到平衡，建立一个稳态浓度分布曲线。色码表明样品中的相对荧光。（c）稳态曲线. 人 体干扰素γ 在不同浓度的结合抗体（黑体x：0.1 nM，红体+ ：80 nM，蓝体# ：500 nM ）条 件下的稳态分布曲线。分子损耗直接反映了结合复合体部分。 为了研究结合反应，测量实验在不同的结合配体浓度下进行。一般来说，带有荧光标记 的结合分子保持固定浓度不变，未被标记的分子被梯度稀释，直到所有结合位点都达到饱和。 Figure 1c 显示了在不同的特定抗体浓度下，人体干扰素 γ （hIFN-γ）的稳态分布曲线。在 抗体低浓度条件下，曲线反映了未结合蛋白分子的热泳动；在抗体高浓度条件下，曲线反映 了复合物的热泳动。对中间浓度来说，测到的分子损耗是结合和未结合状态的线性叠加： 在方程式（1）中ΔCmeasured 是测量到的损耗，ΔCbound 和ΔCunbound 分别代表结合和未结合状态的 损耗，ƒ是分子在结合状态下的部分。在核心区域的浓度变化可以与梯度稀释的配体分子一 起直接转换成结合曲线。从这些数据中可以确定平衡解离常数K 和可能的协同效应。 d 蛋白分子的相互作用. 蛋白分子之间的特殊互作反应在细胞功能里有一个基本原则，而且对 生物技术应用和免疫抗体实验来说十分重要。接下来我们在几个代表性的实验中应用MST， 来显示它在药物开发或者研究领域，在互作反应研究方面使用的可行性。 首先，我们确定抗原hIFN-γ （17KDa）和它的抗体（120KDa）的亲和力。hIFN-γ 是一个 二聚化的可溶的细胞激素，它对细胞内致病菌的免疫和肿瘤控制很重要。hIFN-γ 用