形成rna诱导的基因沉默复合体.pptVIP

* * 2006年诺贝尔医学奖 演讲人： 魏玮 RNA干扰机制 一 获奖者简介 安德鲁·法尔(Andrew Fire) ·1959年出生于美国加利福尼亚州圣克拉拉县 ·1983年获美国麻省理工学院生物学博士学位 ·现任斯坦福大学斯坦福医学院病理学和遗传学教授 克雷格?梅洛（Craig C. Mello ） ·1960年 出生于美国 ·1990年获得哈佛大学生物学博士学位 ·现任美国哈佛大学马萨诸塞州医学院分子医学教授 二 RNAi 机制 1.RNAi 背景 ● RNA interference 由双链RNA（Double Strand RNA简称dsRNA）指导的，在特定酶参与下，以外源或内源mRNA为降解目标，在转录后水平上使特异性靶基因发生的沉默现象 ● 生物界普遍存在的一种古老而进化的高度保守的生物学现象 ● 存在于从真菌到高等植物、从无脊椎动物到哺乳动物的大多数真核生物中，原核生物暂未发现 2. RNAi的发现 ☆ 1990年，科学家Rich Jorgensen将产生紫色素的基因置于一个强启动子后导入开紫花的矮牵牛中，希望得到紫色更深的花，但结果是：矮牵牛花完全褪色，花瓣变成了白色。当时认为这是导入的基因和其相似的内源基因同时都被抑制，并将之称为协同抑制 ☆ 1995年，康奈尔大学的Su Guo博士在用反义RNA阻断线虫基因表达的试验中发现：反义RNA（anti sense RNA）和正义RNA（ sense RNA）都阻断了基因的表达 ☆ 1998年，Andrew Fire和Craig Mello将反义RNA和正义RNA同时注射到秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）比单独注射反义RNA诱导基因沉默的效率高10倍 3.RNAi机理 3.1 dsRNA的形成 ◆ 基因组中DNA反向重复序列的转录产物 ◆ DNA同时转录了反义RNA和正义RNA的互相结合 ◆ 病毒RNA 复制中间体 ◆ 以细胞中单链RNA 为模板，由细胞或病毒的RNA 在有关酶的催化下合成dsRNA等 3.2 siRNA(干扰性小RNA small interfering RNA，简称siRNA)的形成 ▲ RNaseIII家族中特异识别双链RNA的一员 ▲ 含有解旋酶活性以及dsRNA结合域和PAZ结构 3.21核酸内切酶Dicer （1）dsRNA在细胞中大量扩增 （2） dsRNA在细胞中达到一定量时，核酸内切酶Dicer识别并与之结合形成酶-dsRNA复合体 （3）核酸内切酶Dicer 对siRNA进行切割，产生21-23nt长的dsRNA小片段，即siRNA 3.22 siRNA形成过程 3.23 siRNA的特征性结构： ※ siRNA 的序列与所作用的靶mRNA 序列具有同源性 ※ siRNA 两条单链末端为5′端磷酸和3′端羟基 ※ 正义链与反义链各有21个碱基，其中19个碱基配对，在每条链的3′端都有2个不配对的碱基（图1）。 图1 siRNA示意图 3.3 RISC的形成和发挥效应 siRNA和核糖核酸酶复合物结合，形成RNA诱导的基因沉默复合体（RNA-induced silencing complex,简称 RISC） 3.32 RISC 蛋白成分 内切核酸酶、外切核酸酶、解旋酶、同源RNA 链搜索活性酶、Argonaute等 3.31 RISC的形成 ☆ Argonaute有一个月牙型的底座由三部分组成，分别为N-端（amino-terminal）、中部（middle）和PIWI区域（PIWI domain）。月牙底座上面有一个PAZ部分，由茎杆结构支撑。Argonature蛋白有一个凹槽贯穿整个蛋白，凹槽内壁带正电有利于与RNA带负电的磷酸骨架结合 3.33 Argonaute蛋白 ☆ RISC的特有成分，被比喻成“切薄片的机器”。 图2?? siRNA引导mRNA被切割的模型 (1) RISC中的siRNA依赖ATP水解释放的能量而解旋，双链转变成单链而使复合体被激活，得到活性RISC。 (2) siRNA解旋后，siRNA单链的3’端伸入PAZ的裂缝中，整个单链沿着PAZ伸展开，同时目的片段mRNA结合于新月型底座。siRNA反义链与mRNA互补区域结合，形成双链 (3) 在离单链siRNA5’端9个碱基处,由RNA酶切割mRNA，阻断RNA的翻译，达到在RNA水平上干扰基因表达的效果 3.33 效应阶段 紫色 正义RNA段 蓝色 反义RNA段 绿色 目标信使RNA 图4 RNAi原理示意图： siRNA 形成后另外作为一种特