FT基因在桑树生长状态转变中的表达分析.docVIP

　　FT基因在桑树生长状态转变中的表达分析 第一章 文献综述 1.1高等植物成花概述 目前已知的被子植物约有35万种（Litt and Kramer 2010），均具有两性花（完全花）或单性花（不完全花）等有性生殖系统（Tanurdzic and Banks 2004）。有花植物的一个世代可分为胚胎发生阶段（embryogenesis）和胚后器官发生阶段（post-embryonicorganogenesis），其中后者以开花为界又可分为营养生长（vegetative groeristem, SAM）转变为花序分生组织（inflorescence meristem, IM）；（2）由花序分生组织逐步转变为花分生组织（floralmeristem, FM）；（3）花分生组织进而产生花器官原基（floral organ primordia）；（4）由花器官原基再分化为雌蕊、花药等花器官组成部分（Koornneef et al. 1998; Mendoza andAlvarez 1998）。由此可见，高等植物成花诱导是一个复杂的过程，受多种调控途径的影响，是相关基因在时间、空间上有序表达的结果（雍伟东等 2000）。 . 1.2成花诱导的调控途径 随着模式植物拟南芥全基因组序列测定完成，以拟南芥为对象的成花诱导机理研究取得了显著进展。控制植物成花过程的一些主干途径已被探明，并且确定了至少存在四条信号通路调控植物开花时间，分别是光周期途径（photoperiod pathous pathasino 2005）。近年来更深入的研究表明，另有一条 aging path）是指植物通过叶片感知昼夜长短变化，从而使自身生活周期与季节变化同步（王宝增 2013）。根据植物开花时间对光周期反应的差异，可分为长日照植物、短日照植物和日中性植物。通过对植物叶片或茎顶端遮光的相关试验，证明了叶片是植物感知光的部位；而花诱导则在茎顶端发生，这意味着在植物体内存在某种信号能够从叶片向茎顶端转移（Garner andAllard 1920）。在这个理论基础上，前苏联生物学家提出了成花素（florigen）的概念，即在适宜的光照条件下，植物在叶片中产生成花素，并将成花素运输到茎顶端促使开花（Chailakhyan 1936）。植物的光周期途径是由叶片中的光受体（又称色素蛋白）感受光信号开始的。目前已知在植物中至少存在三类光受体，感受可见光光谱中五个区域的光：光敏色素PhyA（PHYTOCHROMEA）、PhyB、PhyC、PhyD和PhyE等感受红光和远红外光（Guo et al.1998; Kobayashi and E1）、CRY2、CRY3（Lin 1998）等感受蓝光和紫外光UV-A；另还有一种尚未鉴定出的光受体则感受紫外光UV-B（Thomas and Vince 1997）。植物通过光受体感受昼夜长短和光的强弱，从而产生昼夜节律，向生物节律钟（circadian clock）传递信号（Yanovsky and Kay 2002）。 第二章 家蚕中肠组织切片免疫组化方法优化 通过比较普通二抗和生物素标记二抗的优劣，为后续家蚕中肠组织切片免疫组化试验确定条件。 2.1 材料 家蚕中肠组织切片 .. 2.2 试验方法 2.2.1 免疫组织化学检测 （1）将家蚕中肠组织石蜡切片进行脱蜡和水化后，在 60℃二甲苯中浸泡 10min，然后于无水乙醇中浸泡 5min，重复浸泡一次； （2）依次用 95%乙醇、85%乙醇和 70%乙醇各浸泡 2min，然后于蒸馏水中浸泡5min； （3）用 PBS 缓冲液（pH7.4）冲洗 3 次，每次 3min； （4）将切片置于 0.01mol/L 柠檬酸-柠檬酸盐缓冲液中，中低火加热 3min，取出冷却至 90℃，再加热 3min，冷却至室温后用 PBS 缓冲液冲洗 3min； （5）加入 200mu;L 0.3%过氧化氢甲醇，室温下避光孵育 15min，然后用 PBS 缓冲液冲洗 3 次，再加入非免疫山羊血清，室温孵育 20min； （6）除去血清后，加入 ATG8 多克隆抗体作为一抗，4℃过夜；（7）用 20%蛋清孵育 30min，用 PBS 缓冲液冲洗 3 次，每次 3min； （8）除去 PBS 缓冲液，加入生物素标记的二抗（对照组加入普通二抗），室温孵育 10min，用 PBS 缓冲液冲洗 3 次，每次 3min； （9）除去缓冲液后，加入链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液，室温孵育 10min，用 PBS 缓冲液冲洗 3 次，每次 3min； （10）除去缓冲液后，加入 DAB 显色溶液显色 5-10s，蒸馏水冲洗 5min，解除显色； （11）加入苏木精染液反应 30s，蒸馏水冲洗 5-10min，PBS 缓冲液返蓝